导读肠道菌群的区域化被认为对系统功能很重要，但对肠道生态系统的空间组织程度仍知之甚少。本文使用激光捕获显微解剖沿纵向和横向轴描绘小鼠结肠微生物群。发现了肠道菌群的精细空间结构，沿结肠长度在组成和多样性上呈梯度变化。纤维的缺失降低了微生物群落的多样性，破坏了微生物群落组成的纵向和横向梯度。与粘膜相邻的群落和管腔的群落都受到膳食纤维缺乏的影响，随着典型的远端结肠微生物群的消失和邻近粘膜群落的减少，黏液层也随之消失。这些结果表明，饮食不仅对肠道菌群的组成有全局性的影响，而且对肠道菌群的组成也有局部性的影响，依位置差异可能会造成功能和恢复力的不同。
论文ID
原名：A fiber-deprived diet disturbs the fine-scale spatial architecture of the murine colon microbiome
译名：纤维缺乏的饮食扰乱了小鼠结肠微生物组的精细空间结构
期刊：Nature Communications
IF：11.878
发表时间：.09
通讯作者：巴里·大卫
作者单位：奥地利维也纳大学
实验设计
1 动物实验
将九只按标准饮食（R / MH Ssniff，Soest，德国）饲养的野生型C57BL / 6小鼠分为三组（每组n = 3），并在各组饮食中维持1周：富含多糖和纤维组（CON）（含纤维素和淀粉）；缺乏纤维的饮食组（FD）（不含纤维素）；缺乏多糖和纤维的饮食组（PFD）（含蔗糖但不含纤维素或淀粉）（Ssniff，Soest，德国）。FD和PFD饮食组是等热量的（补充图 5）。为了验证选定的结果，在单独的饮食转移实验（7天）中包括了六只小鼠（三只FD和三只PFD）。将小鼠共同饲养在可自由获取食物和水的受控环境中（12h / 12h日/夜循环）。第1、4和7天收集粪便颗粒并速冻在液体氮中，新饮食模式的前一天作为第一天，即基线。在第7天，处死小鼠，将盲肠内容物速冻在液态氮中，并将结肠冷冻保存在OCT中，并保存在-80℃。2 液晶模组
将结肠分成七个1cm的块，并从每个块制备10μm的冷冻切片。将冷冻切片安装在经紫外线处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）LCM载玻片（Leica）上。LCM用于从粘液相邻区域（定义为距上皮组织<100 µm）以及远离组织的区域（距上皮组织> 100µm）中提取约100×100 µm的区域，此后分别作为粘液和管腔样品。从每个块中至少从八个区域采样（四个用于粘液，四个用于内腔；补充图 4）。3 16SrRNA基因靶向扩增子测序
用苯酚-氯仿珠样法从粪便样本中提取核酸。对于LCM样品，将冷冻切片捕获在经紫外线处理的组织裂解缓冲液中，提取DNA。采用以大多数细菌为靶点的16S rRNA基因引物(S-D-Bact-0341-b-S-17 [5 -CCTACGGGNGGCWGCAG -3]和S-D-Bact-0785-a-A-21 [5 -GACTACHVGGGTATCTAATCC-3])两步法进行PCR定量扩增子，并使用Illumina MiSeq进行测序。4 测序数据分析
使用8个核苷酸样品特异性条形码将16S rRNA基因序列数据分类到文库中，根据地球微生物计划指南进行质量过滤，并使用分裂扩增子去噪算法（DADA2）处理为扩增子序列变体（ASV），使用RDPclassifier在Mothur进行分类。通过R包鉴定并去除PCR试剂和LCM膜的污染。该程序包使用基于污染特征的统计测试，例如与其他样品相比阴性对照样品中ASVs的普及和丰度。对于污染物鉴定，默认阈值0.1用于基于普及率的统计测试。通过这种方法，鉴定并去除了以前在实验室试剂和试剂盒中据报道是常见污染的细菌序列（见结果）。为避免与文库深度不均相关的偏见，对测序文库进行了子采样，采样的读数数小于最小文库（粪便样品为4000个读数，LCM样品为1000个读数）。1000次读取足以维持每个库的高覆盖率（平均覆盖率：98％）。从随后的分析中除去读数少于1000的样品（产生369个LCM样品）。5 宏基因组分析
为了确定微生物群落的潜在功能，对来自CON和FD饮食的远端结肠样本进行了宏基因组分析。对LCM样品中的DNA进行多次置换扩增，以获得足够的DNA进行测序，然后构建宏基因组文库。使用150 bp配对末端化学对Illumina HiSeq 3000/4000进行文库测序。使用Trim Galore过滤了配对末端的FASTQ文件（软件版本：0.4.1）以删除adapter和短reads（<20 bp），并修剪低质量的末端（PHRED读数<20）。组装是通过SPAdes（软件版本：3.9.0）在单细胞模式下完成的，用于MDA扩增的样品。基因是使用Prokka（软件版本：1.12）预测的。使用RAPSearch（软件版本：2.24），对小鼠肠道宏基因组目录中的蛋白质进行预测，并在单独的分析中将短片段连接起来。对于注释和分类信息，使用自定义脚本来匹配RAPSearch结果（针对log10 e进行过滤）值<−20，长度> 50 bp，位核心> 100，不匹配0，同一性> 99％，缺口开口0），然后对结果进行注释和分类。使用KEGG REST API在线资源检索KEGG本体的注释信息详细信息。6 总代谢组学（LC-QTOF-MS）
在萃取溶剂(15 L/mg含量)存在下均质盲肠内容物(50mg);用实验室搅拌器和钢球混合，然后对样本进行前处理，处理后通过LC-MS与II四极杆飞行时间质谱仪结合进行代谢物的检测。然后将样品提取物（4 µL）注入到Luna氨丙基色谱柱中，以ESI阴性模式进行HILIC分析。代谢物鉴定主要通过METLIN代谢物库，通过精确的质谱比对和MS2谱匹配进行。此外，通过与真实的参考标准品进行比较，进一步验证了许多代谢物。7 NIMS与氟化金纳米颗粒
为了研究小鼠结肠组织中小分子的空间分布，应用了NIMS。NIMS构成了其他成像技术（如MALDI）的独特替代品。代谢物的鉴定是基于与METLIN数据库相比所观察到的分子的精确质量以及观察到的同位素模式。
8 阿尔辛蓝染色
为了观察杯状细胞和分泌的粘液层，将冷冻切片用阿尔辛蓝（阿尔坎蓝色溶液在3％乙酸中1％w / v，pH 2.5）染色。样品在光学显微镜上可视化，并在杯状细胞的40个视野（×100）和35-40个视野（×100）中进行观察。收集粘液以测量粘液层的厚度。9 荧光原位杂交
将远端结肠制备10 µm冷冻切片，使用标准规程进行FISH。补充表1中列出了用于FISH分析的细菌探针。10 图像分析
对于每个样品，使用daime版本2.1程序，从粘液和腔内含量中获取15-20张图像，并分析细胞的生物体积分数和空间排列。使用程序Fiji，每个视野至少测量10个粘液厚度，并使用daime计算杯状细胞的生物体积分数。11 统计分析
使用统计软件R进行统计分析，采用permutational analysis of variance (perMANOVA)评估各因素的统计学意义。使用vegan软件包计算了α多样性指标和β多样性。群落组成中的空间异质性使用泰勒幂定律进行量化，泰勒幂定律将每单位生境面积物种个体数量的方差与其对应的均值联系起来。为了模拟微生物在个体内的分布，进行了AEM分析。AEM框架是一种新的基于本征函数的空间滤波方法，专门用于对假设由定向空间过程产生的空间结构进行建模。选择这种空间分析技术是因为它明确地模拟了方向性生态过程，例如肠道内容物的近－远运动。使用RDA分析对产生的AEM载体进行前向选择，以模拟物种分布。饮食和区室之间的相对丰度差异使用ANOVA进行正态分布，而使用Kruskal-Wallis检验进行非正态分布。事后检验用于饮食组之间的多重比较（分别在ANOVA和Kruskal-Wallis之后进行Tukey检验和Dunn检验），配对t检验用于比较饮食治疗第1天和第7天之间相对丰度的变化。变量表示为平均值±标准偏差（SD）和用于多重比较p-值使用错误发现率方法进行了调整。小于或等于0.05的p值被认为具有统计学意义。通过XCMS在线多组、两两比较，对总代谢组学测量结果进行代谢物特征的统计分析，采用最小折变阈值> 1.5 (p < 0.01)、信号强度阈值10000进行FD或PFD与CON样品的比较。结果
1 激光显微解剖对微生物组谱分析的适用性
该研究评估了低生物量LCM样品的性能，通过(i)评估从LCM样品中提取的DNA生成的剖面的技术重现性，从而可靠地提供准确的微生物组剖面，(ii)比较高输入DNA和低输入DNA的PCR图谱，(iii)评估同一切片相邻区域的相似度。发现从LCM样品中生成的剖面具有很高的技术重现性，而从连续稀释4个数量级以上的相同DNA中生成的剖面高度相似。此外，从同一截面上的八个相邻区域采集的样本具有较高的相似性。这些结果表明，LCM样品可用于稳定而准确地确定微生物组成。低生物量的样品容易受到PCR试剂的污染，使用最新开发的污染物识别方法对其进行了识别，并将其从数据集中删除。该方法将208个ASVs识别为污染物（从4783个ASVs中），平均占LCM样本的4%。除了典型的试剂污染物（如α和β-变形菌），研究者注意到，已鉴定出的一种污染物被归类为不动杆菌。不动杆菌以前曾被报道为小鼠肠道中的一种隐性相关细菌，也曾被报道为一种PCR污染物，因此尝试使用FISH检测它。但是，即使在去除污染物之前，不动杆菌在测序文库中的相对丰度为40%，也无法检测到不动杆菌，研究者的结论是，它确实是一种PCR污染物。2 结肠菌群是分隔的
最近的无菌小鼠研究表明，肠道微生物群的组成根据位置而变化，随相邻于粘膜组织和沿着肠道有不同的微生物群落。为了确定复杂的天然结肠菌群的空间结构化程度，该研究通过沿结肠的长度以及与粘膜相邻和远离的7个部分解剖100 x 100 x 10 µm的生物量，对鼠科结肠通过LCM组织进行了全面采样（以下称为“粘液”和“腔”室）（图1a））。为了量化粪便作为结肠微生物群替代物的适宜性，比较了每只小鼠粪便样本与LCM样本的相似性。在粪便样本中几乎所有的扩增子序列变异（ASVs）可以在结肠整个长度检测到，在粘液和管腔隔室中也可以检测到，但检测水平可变，粪便与远端结肠的管腔群落最相似（图 1b）。虽然结肠中生物量的净运动明显是从近端到远端，但不清楚粘液附近区域是肠道微生物的来源还是汇聚点。为了确定方向性过程影响微生物群落组成的程度，应用了非对称特征向量图（AEM）建模，该模型旨在评估源群落在塑造潜在下游群落组成中的重要性。AEM模型的测试结果表明，沿着结肠进行微生物交换的净方向比较表明，对于黏液和管腔群落，近端群落都会影响远端群落（ANOVA，n = 163，p = 0.001）。但是，没有发现粘液是群落的净来源或汇，这表明粘液和腔之间广泛的双向转移。与AEM建模结果一致，空间成分划分表明，纵向位置明确了微生物群组成变化的19.3％，而粘液腔位置仅明确了1.7％（图 1c）。沿结肠长度观察到ASV丰富度和Shannon多样性的增加，远侧结肠样本比近端或中间结肠更为多样化（图 1d）。粘液和管腔样品均是如此，但是与来自相同纵向位置的管腔样品相比，粘液样品的富集度较低（ANOVA，p = 0.03）。
图1结肠微生物组是分隔的
3 膳食纤维和多糖的剥夺会改变肠道微生物组和代谢组
饮食可以对肠道微生物群的组成有重大影响。为了研究膳食纤维和多糖对微生物群的影响，该研究比较了接受常规饮食（CON）的小鼠与纤维缺乏饮食（FD）或多糖和纤维缺乏饮食（PFD）一周的小鼠。饮食转变引起微生物群组成的急剧变化，主坐标分析（PCoA）排序显示，饮食转换后4天和7天，饮食中粪便颗粒微生物群明显聚集（perMANOVA，p <0.001;图2a）。FD饮食组中微生物群的ASV丰富度和Shannon多样性大大降低，而在PFD饮食组中进一步降低（ANOVA，p <0.0001，图2b）。多糖剥夺显著改变了菌群的组成，最明显的特点是减少了拟杆菌S24-7（ANOVA，p = 0.0002）和通过增加弧菌（ANOVA，p = 0.0002）和瘤胃菌（ANOVA，p = 0.0020）（图2c）为了评估微生物群的变化是否反映了肠道代谢产物的变化，对饮食变化一周后收集的盲肠内容物进行了非靶向代谢组学。代谢组学分析显示，三组之间检测到4200多个代谢特征，其中2100多个存在显著差异（ANOVA，CON和PFD组n = 3，FD组n = 2，p <0.01，最小值强度10000）（补充数据1，补充图6）。饮食对肠道中代谢产物的巨大影响反映在主成分分析（PCA）排序中（图3a）。值得注意的是，随着膳食纤维的去除，短链脂肪酸（SCFA）减少，而随着膳食和多糖的去除，某些SCFA进一步降低（ANOVA，丙酸：p = <0.0001，丁酸：p <0.0001；图3b）。NIMS在结肠切片中也观察到了结肠中SCFA丙酸酯和丁酸酯的减少（图3c）。同样，在无纤维饮食下，小鼠体内的谷氨酸和N-乙酰-谷氨酸含量也较少，而色氨酸和相关代谢产物却增加了。其中包括对甲酚硫酸盐，这是一种尿毒症毒素，在两种缺乏纤维的饮食中明显更丰富（ANOVA，FD组中30.4倍[ p <0.02]，PFD组中12.0倍[ p<0.012]）。这可能是高度相关的，因为这种细菌代谢物已涉及肾脏和心血管疾病，氧化损伤和药物作用降低。正如预期的那样，碳水化合物的含量也受到饮食的显著影响。例如，在FD和PFD饮食中，果糖含量分别降低了1.8倍（ANOVA，p <0.03）和3.3倍（ANOVA，p <0.0014），并且葡萄糖减少了（ANOVA，2.8倍，p <0.05）在PFD组中。饮食显着改变了许多代谢途径，这包括糖胆酸的代谢和胆汁酸的合成，色氨酸和吲哚-3-乙酸酯的生物合成以及蔗糖的降解。
图2膳食纤维和多糖的缺乏会改变肠道微生物组
图3膳食纤维和多糖的缺乏会改变肠道代谢产物的状况
4 饮食影响结肠微生物群的空间结构
使用上述LCM方法，接下来评估饮食是否影响结肠微生物群的空间结构。发现微生物群组成取决于采样位置（纵向和横截面），并且受饮食相关位置影响（perMANOVA，p <0.001）。PCoA分析显示，通过饮食对样本进行了聚类，CON中有一些远端和中端结肠群落的聚类在其他饮食中没有（图4a，补充图1C和补充图2）。群落组成的变化分区显示，饮食解释了25.5％的微生物群落组成变化，纵向位置解释了7％，粘液腔位置仅解释了1.2％（图4b）。类似于粪便样本，FD饮食中整个结肠的微生物群丰富度均降低，而PFD饮食中微生物群丰富度甚至进一步降低。饮食影响粘液和管腔区隔中结肠长度的丰富度（图4c，补充图2），表明与肠腔相似，饮食对粘液相关群落的丰富性也有影响。至于CON饮食，来自FD和PFD饮食的粘液样本的丰富度低于其各自的内腔样本（ANOVA，p = 0.03）。与CON饮食不同，对于FD和PFD饮食，ASV丰富度和Shannon多样性沿结肠长度没有显着变化（图4c，补充图2）。在CON饮食中，近端结肠富含黄杆菌科（ANOVA，p = 0.024），远端结肠富含普雷沃氏菌科（ANOVA，p = 0.0040）和乳杆菌科（ANOVA，p = 0.024）。内腔中富含拟杆菌属S24-7（ANOVA，p <0.0001），拟杆菌科（ANOVA，p = 0.029），普雷沃氏菌科（ANOVA，p = 0.0125），疣微菌科（ANOVA，p = 0.012），乳杆菌科（ANOVA，p> 0.0001）和丹参科（ANOVA，p ＝0.016），而粘液隔室富含鞭毛科（ANOVA，p ＝0.0095）和黄杆菌科（ANOVA，p ＝0.012）。在FD和PFD饮食中，远端结肠中的普雷沃氏菌科和乳杆菌科的富集模式消失了，并伴随着纵轴和横轴上其他几个类群的丰度变化（图4d）。由盲肠样品获得的代谢产物数据也反映了纤维缺乏饮食引起的微生物群落丰富度的降低和变化。当比较低于200 m/z的小分子的特征时，纤维缺乏饮食的总数量减少了约23%，表明代谢的碳水化合物物质或微生物相关代谢物减少了。FD和PFD饮食中黏液层较薄，肠组织中杯状细胞较少（图5a）。使用FISH，发现在所有饮食中，粘液附近的毛螺菌科都很丰富（图.5b，c）。对于CON而言，这种富集扩展到管腔中，在FD饮食组，扩展到管腔30 µm，在PFD饮食组，扩展为12 µm（ANOVA，p <0.05）。
图4饮食会影响结肠微生物群的空间结构
图5粘液层结构因饮食而改变
5 饮食依赖的微生物群落空间斑块
在景观生态学中，栖息地的丧失可能导致群落分裂和群落的空间斑块，这是物种在空间中的非均匀分布。因此，该研究测试了由于缺乏膳食纤维和多糖而导致的结肠营养状况的恶化是否会影响微生物群的斑块。为了确定群落斑块，该研究应用了泰勒的幂定律分析，分析评估了采样点之间所有ASV的相对变异性。发现粘液中微生物群的空间分布比管腔更小，并且有趋势，尽管FD和PFD饮食比CON饮食更不具有统计学意义（图6a）。为了证实这些结果，研究者通过FISH分析了选定的细菌种群。针对的是富含PFD饮食的脱硫弧菌属spp，和富含粘液样本的毛螺菌，包括重要的粘蛋白相关细菌，如真细菌和梭菌簇XIVa。FISH揭示了PFD饮食中细胞的广泛聚集（钩端螺旋体科：在粘液中占20％，在管腔中占28％；脱硫弧菌：在粘液中占2.1％，在管腔中占2.4％），这可能影响总体群落斑块（图6b，补充图7和8）。为了确定群落斑块的潜在影响，研究者对来自CON和FD饮食的远端结肠样本进行了宏基因组分析。与16S rRNA基因分析一致，相对于管腔，CON饮食的粘液中的基因丰富度较低（ANOVA，p = 0.0018，图6c）。在FD饮食中，样品之间的基因含量差异也有所增加，并且在粘液中的含量高于管腔，表明基因编码能力的斑点增加（ANOVA，p = 0.0055，图6d）。此外，每个KEGG功能类别的基因数量也减少了（ANOVA，p = 0.0024，图6e），表明减少了菌群功能冗余。在CON饮食和FD饮食中，在粘液近端区域，碳水化合物活性酶基因的总体多样性降低了，并且几个CAZY家族丰度减少（FDR <0.1；补充图9）。与代谢组学数据一致，参与乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐生产的KEGG类别的基因丰富度降低了。
图6依赖于饮食的微生物区系的空间分裂
讨论
微生物的生物地理学部分受当地环境条件的制约。通常，诸如pH值，氧气和养分利用率等因素是决定宿主相关微生物的生物地理学的主要选择因素。为了确定结肠微生物群的空间结构，本文采用了一种高空间分辨率的方法，对小鼠结肠纵向和横向轴上的微生物群进行采样。结果发现复杂的小鼠结肠菌群表现出细微的组成梯度，该梯度在很大程度上受到沿结肠长度的位置的影响，但在较小程度上也与粘膜组织的距离有关。在富含纤维的饮食中，随着近端结肠中变形杆菌的富集和远端结肠中的菌丝的富集，微生物多样性沿着结肠的长度增加。与这些结果一致，还发现代谢物的丰富性增加。观察到拟杆菌科家族在内腔富集，而一些纤菌纲的家族在粘液中富集，这与人类结肠活检样本以及在野生型小鼠和体外模型的报道一致。总体而言，粘液相关微生物群的组成比管腔更易变且多样化。黏液层通过表面杯状细胞的分泌而不断更新，其快速的周转(大约几个小时)可能导致比腔内更少的定殖和更动态的环境，这将促进附近细菌的短暂定殖。或者这种可变性可归因于不同细菌群的粘液层定殖的不同阶段，这已在其他结构化环境（如牙齿生物膜）中观察到。但是值得注意的是，没有发现仅在邻近黏液的位置才可检测到的物种，建模表明黏液和内腔室之间细菌种群的交换广泛。虽然粘液相邻区域可能是某些细菌的来源，但是这些结果表明不是形成管腔群落的主要因素，黏液相关菌和管腔细菌广泛混合，某些类群优先结合或扩张，以更好地利用黏液生态位。该观察结果与定殖有15个成员的菌群的无菌小鼠的观察结果一致，即结肠没有明显分层的管腔和粘膜区室，而是更好地概念化为不完全混合的生物反应器。短期纤维和多糖的缺乏显著而迅速地改变了小鼠结肠的微生物生物地理，多样性和丰富性。膳食纤维的缺失不仅减少了整个结肠的细菌多样性，而且还导致了特定的远端结肠群落的丧失，分类单元的空间梯度重组以及群落的空间斑块增加。这伴随着微生物发酵功能的损害，由短链脂肪酸如丙酸酯和丁酸酯的水平确定。与以前的研究相一致，短期消除膳食纤维导致粘液层降解并减少上皮组织中产生粘液的杯状细胞。这可能是由于丁酸水平的下降，丁酸水平是结肠细胞的重要能源，胆汁酸代谢的改变，可能会改变结肠的粘液分泌，或觅食粘液和产硫细菌的增加，例如脱硫弧菌,生成硫化氢攻击二硫键，使它们更易降解。长期缺乏食物纤维可能导致代偿性宿主反应和粘液层正常化。这些结果强化了膳食纤维对结肠微生物群落多样性和功能的重要性，但也强调了膳食纤维是微生物群落划分的关键驱动力，这可能对局部群落功能、微生物和宿主代谢、粘液屏障功能和抗扰能力有影响。总而言之，这项研究对鼠结肠中微生物的空间和代谢组织以及多样性建立了新的见解。表明复杂的结肠菌群具有空间结构，膳食纤维和多糖的缺乏不仅降低了整个结肠内肠道微生物组的多样性，而且破坏了菌群组成的纵向和横向梯度，多样性以及整体代谢。这表明膳食纤维在塑造结肠菌群区隔中起关键作用，并且可能对宿主-微生物相互作用具有重要意义。
Nature Communications：宏基因组和代谢组等多组学揭示了纤维缺乏的饮食扰乱了小鼠结肠微生物组空间结构
