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摘 要
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帕金森病 (PD) 是一种以黑质致密部 (SNc) 多巴胺 (DA) 神经元缺失为特征的神经系统退行性疾病。在约 15% 的病例中发现 Parkin、Pink1、DJ-1、α-synuclein、LRRK2 和 GBA 等基因的罕见基因突变是导致该病的原因。
帕金森病的运动症状与大脑中一类释放化学信使多巴胺的神经元的年龄依赖性变性有关。选择性地失去这些神经元的原因是一个关键的未解决的谜团。一种假设是，这种疾病中最危险的神经元是大脑中连接最广泛和最复杂的神经元，这将使这些细胞最依赖于高速率的线粒体能量产生，并使它们面临更高的氧化应激率。
在这里，我们选择性地删除了多巴胺神经元中一个提供负反馈控制这些神经元轴突大小的关键基因，目的是产生多巴胺神经元具有更广泛连接性的小鼠。我们发现多巴胺D2受体基因在多巴胺神经元中的缺失导致多巴胺神经元具有更长、更复杂的轴突结构域。
我们还发现，在这些老鼠中，大脑中一个叫做黑质的区域的多巴胺神经元对一种神经毒素的脆弱性增加了，这种毒素常被用来模拟啮齿动物的帕金森病。我们的发现支持了这样的假设，即神经元的连接程度直接影响其易受细胞应激源的影响，从而引发帕金森病。
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结 果
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结果1：SNc DA 神经元比 VTA DA 神经元在小鼠脑内有更详细的纹状体轴突树枝状化
图 1. SNc DA 神经元较 VTA DA 神经元有更长的轴突树状突起
通过在成年 DAT-Cre 小鼠中进行 AAV 注射，在 SNc 或 VTA SNc DA 神经元中条件性表达 eYFP，并通过免疫荧光标记显示 eYFP 和 TH (A)，来评估轴突树状突。然后在纹状体 (B) 观察轴突树枝状化的程度，并测量腹侧和背侧纹状体 VTA (C) 和 SNc (D) 靶向注射的程度。直接 (E) 和相对 (F) 比较整个纹状体轴突分支的大小。N = 3 脑/组，均数±标准差，*p > 0.05。
结果2：D2-cKO 中 DAT 表达增加，但纹状体表达没有增加，神经元数量没有变化
图 2. D2-cKO 小鼠 DAT 表达增加，而 TH 纹状体表达没有增加，DA 神经元数量没有变化
测定对照组和 D2-cKO 小鼠腹侧和背侧纹状体 TH (A) 和 DAT (B) 免疫荧光水平。比例尺 = 50 μm。使用 DAT 信号定量覆盖面积 % (C,F)、平均信号强度 (D,G) 和积分信号 (E,H) TH 和 DAT 信号以及纹小体数量 (I) 及其大小 (J)。N = 15-22 脑/组，均数±标准差，*p > 0.05。体视学计数法测量黑质致密部 (SNc)、VTA 和 RRF (K) 内 DA 神经元的数量。N = 4-5 个大脑/组，平均值±SEM。
结果3：D2-cKO 小鼠 SNc 而非 VTA DA 神经元的轴突树枝状突起增大
图 3.D2-cKO 小鼠 SNc 而非 VTA DA 神经元轴突树枝状突起增大
在成年 DATIRES-Cre/+ ;DRD2LOX/LOX 小鼠 SNc 或 VTA DA 神经元中使用 AAV 注射选择性显示 SNc 或 VTA DA 神经元的轴突分支。在纹状体观察轴突树枝状化的程度，并测量 SNc (A) 和 VTA (B) 靶向注射的腹侧和背侧纹状体。N = 6-10 脑/组，均数±标准差，**p > 0.01。YFP 阳性的 SNc 多巴胺能轴突 (C) 与 TH 和 DAT 的共定位，TH 和 DAT 的共定位用 Mander’s 系数（M1 和 M2）测量 (D)。YFP 阳性的 SNc 多巴胺能轴突 (E) 与 VMAT2 的共区域化和 VMAT2 与 DAT 的共区域化用 Mander"s 系数 (F) 测量。M1 = 信号 1 与信号 2 共定位的比例，M2 = 信号 2 与信号 1 共定位的比例，比例尺 = 80 μM。N = 24-35 张图像/组，平均值±SEM，*p > 0.05，***p > 0.001，****p > 0.0001。
结果4：减少 D2-cKO 小鼠纹状体 DA 释放，但不改变 DA 再摄取动力学或纹状体表面 DAT 水平
图 4. D2-cKO 小鼠纹状体 DA 释放减少，DA 再摄取动力学或纹状体表面 DAT 水平无变化
使用循环伏安法测量在急性脑片 (A) 上单次电刺激期间腹侧和背侧纹状体 (B) 的 DA 释放量。在存在 DAT 拮抗剂诺米芬辛的情况下也使用单一刺激 (C)。DA 再摄取动力学是从对单脉冲刺激反应的记录中提取的，通过拟合一个指数曲线，该指数曲线基于纹状体背侧 (D) 和腹侧 (E) 的 Michaelis-Menten 方程。N = 8-9 脑/组，均数±标准差，*p > 0.05，***p > 0.001。对对照组和 D2-cKO 小鼠 (F) 的纹状体进行表面生物素化分析。使用 ImageJ 凝胶分析软件将生物素标记的表面 DAT 条带强度标准化为 Na +/K +-atp 酶条带强度。N = 10 脑/组，平均值±SEM。
结果5：来自 D2-cKO 的 SNc DA 神经元对 6-OHDA 更敏感，但对 α-synuclein 过表达不敏感
图 5. 来自 D2-cKO 的 SNc DA 神经元并不更容易受到 α-synuclein 过表达的影响
α-synuclein 病毒过表达在 mesencephalon 被用来评估 D2-cKO SNc DA 神经元的轴突树状突起的增加对其易损性的影响。用体视学方法对中脑 (A) 区 SNc TH + (B)、RRF TH + (C)、SNc TH-(D) 和 VTA DA 神经元 (E) 进行计数。N = 9 只大脑/组，平均值±SEM，**p > 0.01，****p > 0.0001。比例尺 = 1 mm 和 50 μm。在背侧和腹侧纹状体 (F)，测量 TH 信号区 (G)、平均信号强度 (H) 和整合信号 (I)。N = 9-12 脑/组，均数±标准差，**p > 0.01，***p > 0.001。比例尺 = 1 mm 和 50 μm。
图 6. 来自 D2-cKO 小鼠的 SNc DA 神经元更容易受到 6-OHDA 的伤害
用 6-OHDA 部分损毁模型评价 D2-cKO SNc DA 神经元轴突树状突起增大对其易损性的影响。(A) TH 免疫组织化学显示野生型小鼠纹状体沿头尾轴不同位置多巴胺能神经支配的密度。(B) TH 免疫组织化学用于定位和计数 SNc、RRF 和 VTA 中 DA 神经元的数量。体视学计数 TH + SNc (C)、RRF (D)、VTA (E) 和 TH-SNc 神经元 (F) 的存活数量。N = 10-11 大脑/组，平均值±SEM，*p > 0.05，***p > 0.001，****p > 0.0001。测量背侧和腹侧纹状体 TH (G) 的信号面积 (J)、总面积 (H) 和信号强度 (I)。DAT 也在背侧纹状体 (J,K,L) 中定量。N = 6-8 个大脑/组，平均值±SEM，****p > 0.0001。
图 7. 注射 6-OHDA 后的行为变化
在踏步试验中测量了爪偏好 (A) 和总步数 (B)。在基础状态 (C) 和苯丙胺给药后 (D) 评估旋转行为。还测量了旋转总数 (E)。N = 4-11 个大脑/组，平均值±SEM，**p > 0.01，****p > 0.0001。
在 PD 研究中一个尚未解决的关键问题是为什么黑质致密部的 DA 神经元特别脆弱。在过去的几十年里，许多假说提出了核心特征负责这一脆弱性，包括 DA 和铁毒性，起搏活动和建立一个大型和复杂的轴突树状。
这些特征之间的一个共同点是，它们均导致氧化应激和生物能量需求增加，这在病理学中很容易不稳定。我们先前的体外研究表明，与 VTA 中不太脆弱的 DA 神经元相比，SNc DA 神经元具有更高的线粒体氧化磷酸化率和基础氧化应激，这些特征似乎是其高度复杂的轴突树状突起的结果。这些结果表明，轴突树枝状化的大小可能是区分 PD 中存活和变性神经元的关键决定因素。
此外，D2-cKO 小鼠黑质-纹状体系统中潜在增强的氧化应激水平也有可能没有充分升高，以促进响应所有 PD 病理触发的脆弱性增强。
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