本文刊于：中华心血管病杂志, ,46(7) : 577-580
作者：刘磊 曾彬
单位：武汉大学人民医院心血管内科
近年来的研究表明，成年心肌细胞有重新进入细胞周期的能力，尽管这种能力很低[1]。研究认为，在青春期后不管是小鼠还是人类心脏，心肌细胞再进入细胞周期都处于低水平，很少会产生新的心肌细胞[2]。当发生心肌梗死或心脏受到其他损伤时，非常有限而缓慢的心肌细胞增生并不足以修复受损心脏，使心脏功能恢复正常。因此，通过促进心肌再生修复受损心肌以重建健康心肌，成为治疗心脏损伤的主要目标。近年来研究促进心肌再生的方法越来越多，而以干细胞法诱导心脏再生的研究最突出，也取得很多新进展，本文总结目前干细胞法促进心脏再生的几种研究方法。
1．骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cell,BMSC）：
BMSC能够分化为不同的组织细胞类型，包括心肌细胞。BMSC目前是治疗心肌梗死后心脏再生的研究热点。Khan等[3]报道，表达细胞因子受体c-kit的BMSC能够分化为心肌细胞并使受损心肌再生，将c-kit+-BMSC直接注入梗死心肌组织，可以明显减少梗死区心肌纤维化并改善心功能。研究发现c-kit+-BMSC是BMSC的一个主要类型[4]，可参与成年心脏再生反应，激活Notch通道可促进c-kit+-BMSC分化为心肌细胞[5]。心肌梗死或心脏受损后，表达干细胞抗原-1（stem cell antigen-1，Sca-1）的细胞能诱导成年心肌细胞进行增殖，与Sca-1-细胞治疗相比，Sca-1+细胞治疗能减轻透壁性心肌坏死程度，减少梗死面积，减轻梗死区心肌瘢痕形成，增加心肌组织小血管密度，改善心室功能；Sca-1能诱导更多的梗死区及梗死边缘区心肌细胞进入细胞周期进行细胞增殖[6]。Sca-1+-BMSC能通过血小板衍生生长因子受体-β（Platelet derived growth factor receptor，PDGFRβ）信号通路诱导心肌增殖，PDGFRβ可以激活Ras/MAPK信号通路分子K-RAS、p-Raf1、p-MEK1和p-ERK1/2，从而诱导心肌细胞增殖[7]。Sca-1+/CD45+/CD31+-BMSC可以有效分化为心肌，并能改善急性心肌梗死后心功能[8]。然而，目前移植BMSC的细胞存活率不高[9]，原因是梗死区缺乏血液供应及营养以及自由基的产生造成损伤，而且移植的BMSC不能保持形态稳定，也不具有电生理功能。应用BMSC的临床试验正在逐步开展，解决BMSC的移植存活率问题是目前需要解决的基本问题，使之真正成为治疗心肌梗死后损伤心脏再生的有效途径。
2．内源性心脏干细胞/祖细胞（endogenous cardiac stem cells/progenitor cells,CS/PC）：
CS/PC有不同类型，包括c-kit+细胞、Sca-1+细胞、心球样细胞团源性细胞（cardiosphere-derived cells,CDC)、islet-1+细胞和心外膜来源细胞，它们都可以分化为心肌细胞、平滑肌细胞或内皮细胞。心肌梗死后，内源性心脏祖细胞（endogenous cardiac progenitor cells,CPC）能分化为心肌细胞，替代梗死区坏死心肌细胞[10]。CPC能从心肌组织中分离并在体外进行培养，可以改善梗死后心室功能，减轻心室重塑。心肌梗死后通过冠状动脉注射CPC 1个月，能减轻左心室功能不全，1年后梗死区瘢痕面积减小，存活心肌数目增多，左心室结构改善，左心室射血分数增加[11]。研究还发现心肌梗死后，与单一CPC治疗比较，重复给予CPC能更有效地改善心功能[12]，这为CPC临床应用提供了重要研究方向。CDC包含可分化的心脏祖细胞、心肌细胞样细胞和血管细胞，可以自我更新、克隆并表达不同的干细胞标志物，如c-kit和Sca-1。CDC能减少梗死区心肌瘢痕面积，提高左心室射血分数，改善心功能，且去除c-kit+细胞对CDC的心肌梗死后心脏修复作用没有太大影响[13]。
大麻素2型（cannabinoid,CB2）受体激动剂能有效增加心肌受损后CPC增殖，通过PI3K/Akt/Nrf-2信号通路减轻梗死区氧化应激和炎症反应，提高左心室射血分数，减轻纤维化，从而改善心功能[14]。肝细胞生长因子可促进c-kit+心脏干细胞增殖并分化为心肌细胞，从而促进梗死后心脏修复，改善心功能[15]。Hariharan等[16]报道，干细胞因子可通过介导Pim-1信号通路调节CPC，减缓CPC衰老，保持细胞形态及功能。与骨髓来源干细胞及间充质干细胞相比，CS/PC能更好地诱导心肌细胞分化和刺激冠状动脉生成，并能产生大量生长因子，包括抗凋亡蛋白、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）和血管内皮生长因子（VEGF）[17]。这些因子可能是心肌梗死后心功能改善的潜在机制，但每种因子的作用还需要进一步研究。
3．胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESC）：
ESC是胚胎发育早期由囊胚内细胞团分离培养的细胞，这种细胞保留着能分化为任何细胞的能力。ESC可以分化为心肌细胞，但成年或新生心肌组织不能提供人ESC（human embryonic stem cells, hESC）分化为心肌细胞的微环境，将未分化的hESC植入小鼠心脏会导致畸胎瘤的形成；将预分化的hESC来源的心肌细胞（human embryonic stem cells derived cardiomyocytes，hESC-CM）植入未受损心脏或梗死后心脏则没有畸胎瘤形成，而且这些细胞能在心肌组织中存活和增殖，并能减轻心肌梗死面积和改善心室重塑，延长心室射血时间并提高左心室射血分数,促进梗死后心功能恢复[18]。将hESC-CM移植到无胸腺大鼠的心脏，其存活率高达4周[19]。将hESC-CM细胞移植到非人类灵长类动物心脏，可使梗死后心肌再生，而且移植细胞与原宿主心肌细胞形成电生理连接，移植区细胞表现出与宿主心电图同步的正常钙瞬变[20]，但出现了非致死性心律失常。
骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）能使ESC直接分化为未成熟心肌细胞，过表达Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain containing 5,Fndc5）的鼠胚胎干细胞能更好地分化为心肌细胞，Fndc5可以促进胚胎干细胞分化为心肌细胞[21]。心肌梗死后最初几天组织损伤和炎症反应达到高峰，细胞移植在这个急性反应期存活率很低，而进行hESC-CM细胞移植前用血红素氧合酶-1(Ho-1）激动剂预处理hESC-CM，能增加细胞在梗死区心肌的存活率[22]，因此能更有效地促进心肌梗死后心脏再生。Notch信号通路存在于干细胞上，激活Notch通道能促进hESC分化为心肌细胞，并能激活心血管干细胞分化，从而促进大量心肌细胞再生[23]。研究发现，ESC产生的外泌体中含有独特的microRNA、蛋白质及细胞周期激动剂，能促进更多的心肌梗死后心肌细胞重新进入细胞周期，并能促进CPC增殖、存活及分化为心肌细胞，从而促进梗死后心脏结构和功能修复[22]。
由于hESC治疗可能存在致畸胎瘤、心律失常、移植存活率低及存在伦理问题，且许多机制还未明确，目前的研究只限于动物实验，因此需要进一步研究使hESC诱导心脏再生成为一种可行途径并进行临床试验。
4．诱导的多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSC）：
研究发现C-myc、Oct4、Sox2和Klf4 4个基因维持着干细胞的多能性，表达这些基因的小鼠成纤维细胞可以转化成类似于ESC的细胞[24]，这些细胞被称为iPSC。研究表明，iPSC可以分化为心肌细胞，并且iPSC分化的心肌细胞具有与来源于ESC的心肌细胞相同的特性[25]。
将GATA4、Mefc2和Tbx5（GMT）转染到小鼠成纤维细胞中，可以诱导20%的成纤维细胞转变为心肌样细胞，且培养3 d后可检测到心肌细胞特异性蛋白表达[26]。将GMT转染到梗死后心肌细胞或将这些转录因子与多克隆抗体结合，可以使梗死周边区4%~35%成纤维细胞转化为心肌细胞，从而减少瘢痕面积并改善左心室功能[27]。转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β）抑制剂、Wnt抑制剂和GMT一起作用于心肌梗死后心肌，可以更明显地促进心脏成纤维细胞直接转化为心肌样细胞，心功能也得到明显改善[28]。研究显示，表达血小板衍生生长因子受体（platelet derived growth factor receptor,PDGFRA）的iPSC具有更高的分化为心肌细胞的潜能[29]。通过外源基因导入成年哺乳动物体细胞，基因表达调控蛋白或microRNA来诱导成熟体细胞转化为iPSC[30]。这些研究表明，iPSC-CPC可以有效促进心脏再生。
随着研究的深入，诱导iPSC的途径越来越多，且iPSC是从自体体细胞诱导转化，不存在伦理问题，也不存在免疫排斥反应。然而，目前iPSC分化为心肌细胞的效率低，iPSC分化的心肌细胞钙处理、肌浆网功能及对肾上腺素能系统反应能力还不够成熟[31]。iPSC应用于心血管疾病的临床研究表明，iPSC分化的心肌细胞是不成熟的心肌细胞，不适用于人类疾病模型，且存在潜在的致畸和致心律失常问题[32]。心肌梗死后需要大量的心肌细胞再生来修复心脏结构和功能，提高分化效率、解决诱导的心肌样细胞的结构与功能问题、减少可能致畸和致心律失常的风险问题以及诱导iPSC的分子机制，是目前需要解决的问题。随着技术的提高和研究的深入，相信这些问题可以逐步解决，并能最终成功运用于临床，为心脏再生提供有效的途径。
5．心外膜来源细胞（epicardial derived cells，EPDC)：
由于心脏包含心肌细胞和其他类型细胞，因此心脏再生不仅需要有收缩功能的心肌细胞，同时也需要新生血管以提供心肌细胞营养。EPDC具有在体外和体内分化为成纤维细胞、冠状动脉平滑肌细胞和冠状动脉内皮细胞的潜力。研究发现，心肌梗死后心外膜细胞激活并促进成纤维细胞、血管内皮细胞增生，低等脊椎动物心肌梗死后内源性心外膜细胞激活并诱导新的心肌细胞生成，以取代丢失的心肌细胞，而小鼠心肌梗死后诱导生成的心肌细胞数量显著减少[33]。胸腺素β4可使成人心外膜细胞恢复多能性，在心脏发育过程中心肌分泌的胸腺素β4可刺激EPDC向内迁移并分化为冠状动脉平滑肌细胞，胸腺素β4可以诱导体外培养的成人心外膜细胞大量增殖，并分化为Ⅰ型前胶原成纤维细胞、表达平滑肌肌动蛋白α的平滑肌细胞和表达血管内皮生长因子受体2的内皮细胞，胸腺素β4也可刺激成人心外膜细胞分化为表达肌钙蛋白T的心肌细胞[34]。肾母细胞瘤-1(Wilms tumor-1，Wt-1）与激活心外膜细胞有关，可以使心外膜细胞再生及分化为心血管细胞；心包液中含有的外泌体可以增加梗死周边区血管密度并降低心肌细胞凋亡率，从而改善心功能，这些保护作用与外泌体激活心外膜细胞有关[35]。卵泡抑素样1蛋白（Fstl1）是心外膜细胞分泌的一种活性蛋白，可通过刺激心肌细胞重新进入细胞周期进行增殖，逆转心肌死亡和心室重塑，改善心肌梗死后心功能[36]。
Ding等[34]的研究显示，在心肌梗死后小鼠心脏的心外膜层有WT-1/PDGFR-ɑ及Ki-67的表达，心外膜细胞层的平滑肌细胞能迁移到心外膜下层的坏死组织中，并参与梗死边界区新生血管形成。通过Wnt/β-catenin信号通路可以诱导人多能干细胞分化为心外膜细胞，这些分化的心外膜细胞含有心脏本身心外膜细胞的许多特征，包括上皮细胞的形成、心外膜蛋白Wt-1/TBX18和ALDH1A2的表达、生产成纤维细胞和血管平滑肌细胞，且这种心外膜细胞在TGF-β抑制剂作用下能长期自我更新[37]。心外膜下心肌中检测到表达KI-67+的心肌细胞，也证明心外膜细胞能分化为心肌细胞，但心外膜细胞分化为心肌细胞的概率很低，仅不到1%[37]。心外膜细胞向间充质细胞转变过程由心肌细胞和心外膜细胞来源信号分子调节，心外膜缺失特异性FGFR1/2、PDGFRα或者PDGFRβ会导致该过程不正常化及心外膜来源细胞分化能力缺陷[38]，而TGFβ2/PDGFBB诱导的心外膜细胞向间充质细胞转变过程需要激活核因子-κB[39]。
心外膜来源细胞可以成为促进损伤心肌再生的一种有效细胞类型，为心脏再生提供了一种可行途径。然而，心外膜细胞激活及向间充质细胞转变过程的分子机制尚未明确，如何有效激活心外膜细胞仍是目前研究的重点。另外，胚胎心外膜细胞的信号通路和受体水平与成人心外膜细胞不同[40]，识别两者的差异有助于更好地研究心外膜细胞对梗死后心肌的保护作用。
6．干细胞诱导心脏再生存在的问题：
一项干细胞治疗急性心肌梗死患者临床试验的荟萃分析显示，与标准疗法比较，干细胞治疗急性心肌梗死患者可提高左心室射血分数，治疗6个月后增加了2.23%，12个月后增加到3.91%；BMSC治疗急性心肌梗死患者6个月后左心室射血分数增加2.12%，但其改善并不明显[41]。干细胞疗法虽然显示出治疗6个月后左心室收缩功能改善及心肌梗死面积减少趋势，但与对照组比较，干细胞治疗并没有明显减少心肌梗死面积，也没有明显改善左心室舒张功能[41]。这也让我们怀疑，干细胞治疗急性心肌梗死是否仅仅增强了左心室收缩功能，而没有促进心肌再生，没有促进心脏结构修复，或者促进心肌再生的速度很慢，以至于短期效果并不显著。
干细胞来源的心肌细胞大多为不成熟心肌细胞，如肌原纤维束结构比较散乱，心肌细胞长度不够或者只能部分表达心肌细胞特异性蛋白等。对于iPSC来说，病毒介导的转基因整合体可能导致外源基金插入部位基因突变或相邻片段基因表达改变，可能导致细胞功能失调、肿瘤及相关疾病。此外，这些外源基因的持续表达会增加肿瘤形成风险，如C-myc基因的持续表达会增加小鼠形成肿瘤的风险[42]。iPSC和ESC移植会导致畸胎瘤和心律失常等，且干细胞移植有存活率低的问题。骨髓来源干细胞移植入体内后，只有不到5%的细胞能够存活下来并发挥促心脏修复作用[43]。此外，异源性干细胞移植可能会造成严重的免疫排斥反应，胚胎干细胞存在伦理问题。
7．展望：
近年来，随着干细胞相关研究的不断深入，干细胞诱导心脏再生技术不断获得突破，心肌细胞再生从不可能成为了可能。然而，干细胞诱导心脏再生研究仍有许多问题没有解决，目前大多数研究只限于体外细胞实验和龋齿类动物实验。出于安全考虑，用于实验动物心脏再生的研究方法并不一定适合应用于人类心脏再生研究，且缺乏干细胞治疗心肌梗死后心脏再生的临床试验，无法评估其疗效。干细胞诱导心脏再生的机制目前还未明确，需要深入研究避免致瘤及致心律失常等风险，诱导更为成熟的心肌细胞并开展临床试验以评估疗效。一些细胞因子和microRNA可以促进干细胞分化为成熟心肌细胞，通过改善心肌细胞微环境提高干细胞移植存活率，通过激活相关信号通路促进心肌增殖。相信随着研究的深入，干细胞疗法必定能逐步应用于临床，为心肌梗死患者带来更多获益。
参考文献（略）
