具中科博生研究发现，间充质干细胞（mesenchymal stem cel,MSC)是造血基质细胞的祖先细胞,它与分化产生的多种造血基质细胞共同组成了造血微环境,以支持造血。
近来研究发现,MSC不仅可以分化为造血基质细胞,还可以分化为多种其他类型的细|脚,如成骨细胞、成软骨细胞、肌腱等,甚至还可以分化为来源于不同胚层的神经细胞。MSC以其广泛的分化潜能及易分离、易扩增等特点日益受到人们的关注。但是,MSC的分离纯化方法目前尚无统一方案,不同的实验室有不同的方法。下面介绍几种常用方法。中科博生。
鼠骨髓 MSC的分离
以二氧化碳窒息法处死大鼠,在无菌条件下取股骨和胫骨,除去骨表面附着的组织,用PBS清洗干净;用骨钳除去股骨近端和胫骨远端,暴露骨髓腔。然后除去股骨、胫骨另一端的骨需,并用大号针头在骨端的生长面上开一个小孔;用注射器吸10ml含血清的DMEM-LG培养液,换上干净针头。将针头从上述小孔插人骨髓腔中,注射培养液,从骨的另一端收集冲洗出来的骨髓;将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸,以打散组织成为细胞悬液;收集细胞悬液,离心。中科博生。
用含血清的 DMEM-LG培养液重新悬浮沉淀的细胞;取少量细胞悬液与等量 4%乙酸混合以溶解红细胞。然后计数有核细胞,算出细胞悬液中有核细胞的密度。用含血清的DMEM-LG培养液调节细胞密度。然后将5×10'个有核细胞接种到直径为10cm 的培养皿中。于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO。培养箱中培养。每隔3～4d换液一次。中科博生。
人骨髓 MSC的分离
无菌条件下抽取健康成人骨髓,加肝素抗凝;将肝素抗凝骨髓与等体积PBS混合,用吸管吹打分散细胞。在室温下离心（900g,10min）,弃上清;加入PBS悬浮细胞,调节细胞密度为4×10'个/ml;在离心管中先加入1.073g/ml的Percoll溶液,再将5ml细胞悬液铺于其上。离心（900g,30min）收集界面上的细胞,加人 DMEM-LG培养液清洗。离心收集细胞;用DMEM-LG培养液重新悬浮细胞,计数细胞,调节细胞密度;将细胞以1.6×10°个/cm²的密度接种于培养瓶中,在37℃、5%CO、饱和湿度的CO。培养箱中培养。48h后换液,以后每3～4d换液1次,当培养的细胞相互汇合达到90%的生长表面时,用胰蛋白酶(0.25%）-EDTA（0.1%）液消化分散细胞,进行继代培养。中科博生。
人脐带血MSC的分离
取足月正常生产的胎儿脐带血,加肝素抗凝;将肝素抗凝脐带血与等休PBS 混合,然后按4:1与0.5%甲基纤维素混合,室温沉降红细胞30min:吸取上层液体,离心;弃上清,用PBS重悬细胞;在离心管中先加人1.07的Ficol-Hypaque 溶液,再将 5ml细胞悬液铺于其上。离心（900g,30min）
下步骤同上。中科博生。
在原代培养物中,除了呈成纤维细胞样的MSC外,还混杂着一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等,要得到较均一的MSC,,必须除去其他细胞。根据污染细胞的特性,可采用不同的方式排除它们,对于红细胞,因其不贴壁,可通过换液除去。对于贴壁的细胞,可根据其黏附能力的不同,通过调整胰蛋白酶-EDTA的消化时间,保证 MSC在短暂的时间内与培养皿底分离,而巨晚细胞、单核细胞、造血细胞等仍然贴附于培养皿底,从而使MSC得到纯化。中科博生。
选择合适时间的贴壁细胞。如果选用贴壁过早的细胞(1～3h）,则因贴壁细 胞数量太少,细胞生长困难;如果选用贴壁过长的细胞（超过48h）,在倒置显微镜下可见大量造血细胞黏附在贴壁细胞上面呈集落生长,随着培养时间的延长,贴壁细胞形态出现多样性,细胞传代周期延长,易出现细胞老化等现象。中科博生。
筛选最适于 MSC生长的血清。血清对于MSC的生长非常重要,一定要对不同批次的血清进行比较,筛选出最适合MSC生长的一个批次(血清的筛选方法见 ESC的分离一节)。另外,血清的浓度也很重要,并非浓度越高越好,高浓度血清由于含有大量促进细胞分化的因子,易引起细胞分化,使细胞过早出现老化,反而不利于干细胞的生长,一般以5%～10%的胎牛血清最适宜 MSC生长。
中科博生期待大家一起探讨学习。
