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文章来源：中华放射学杂志,,54 (05): 491-494
作者：卞超凡 吕维富 俞傲 刘开才
摘要选取健康纯种新西兰大白兔28只，以抽签法随机抽出7只为对照组，其余21只建立VX2肝癌模型并进行经导管肝动脉栓塞化疗术（TACE）。于TACE术前1d和术后1、5、10 d分别经耳缘静脉取外周血后测量血清谷丙转氨酶（ALT）、二胺氧化酶（DAO），D-乳酸（D-LA），Toll样受体4 (TLR4）和血清脂多糖（LPS），采用单因素方差分析比较手术前后差异，并以Pearson相关性分析评价ALT、DAO与LPS两两间相关性。结果显示与对照组比较，VX2肝癌模型兔血清ALT、DAO、D-LA、LPS、TLR4均增高，差异有统计学意义（P<0.05），且术后1 d高于术前，术后5 d和术后10 d降低，DAO、D-LA、LPS、TLR4术后10 d均低于术前（P<0.05）。ALT与DAO、DAO与LPS、ALT与LPS均呈正相关，r分别为0.43、0.83、0.64（P<0.05）。本研究结果表明VX2肝癌模型兔在行TACE治疗后，随着肿瘤的控制和肝肠循环的改善，能提高肠道屏障功能，降低血LPS含量，下调TLR4，协同影响肿瘤疗效。
Marshall于1998年提出了"肠-肝轴"的概念，将肠道和肝脏这两个以往认为无密切相关的器官联系在一起，认为慢性肝病会导致肠道黏膜损伤，加重肠道功能失调和代谢异常。二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）活性和D-乳酸（D-lactate，D-LA）水平能较好地反映肠黏膜损伤和肠道通透性[1]。经导管肝动脉栓塞化疗术（transarterial chemoembolization，TACE）是不可切除肝癌的首选治疗方案，但TACE术后肠道的屏障功能是否能得到改善，肝功能改变与肠道通透性之间是否存在关联，以及能否通过此途径协同TACE疗效尚不清楚。本研究中，笔者观察TACE术后兔移植肝癌模型的肠道通透性、肝功能、血清脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和Toll样受体4 （Toll-like receptor 4, TLR4）的变化情况。 1．实验材料：健康纯种新西兰大白兔28只，均为雄性，体重2.5~ 3.0 kg，由安徽医科大学附属安徽省立医院动物中心提供[SYXK（皖）-005 ]。VX2肿瘤购于南京博世鑫公司，接种至健康新西兰大白兔的后肢，保种传代。TLR4、DAO、D-LA试剂盒购于武汉基因美科技有限公司，LPS试剂盒购于厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）试剂盒购于南京建成公司。碘化油为恒瑞医药生产的罂粟乙碘油，吡柔比星（theprubicin, THP）生产自深圳万乐药业有限公司。2．实验动物分组及模型建立：以抽签法随机抽出7只为对照组，其余21只为模型组，建立VX2肝癌模型。将荷瘤兔肿瘤组织取下，取其生长旺盛部分，采用改良开腹穿刺法接种瘤株。将实验兔全麻后仰卧固定，备皮，消毒。于剑突下腹正中偏左侧作长约2cm的纵行切口，逐层开腹，暴露肝脏，将3~ 5个瘤块置于18G穿刺针中，斜行刺入肝脏深度1.0~ 1.5 cm，插入针芯，拔出穿刺针，置入2.0 mm×2.0 mm× 5.0 mm明胶海绵条，轻压2~ 3 min，回纳肝脏，逐层缝合切口。3．TACE手术：于瘤株植入后2周对实验兔行CT检查，待其肿瘤大小约2 cm后入组，行TACE术治疗，术前1 d经耳缘静脉采集外周血液。TACE手术步骤：右侧腹股沟区备皮、消毒、铺巾，沿股动脉搏动处纵行切开皮肤，钝性分离右侧股动脉，置入4 F血管鞘（日本泰尔茂）超选择至肝固有动脉，尽量将导管头引入肿瘤滋养血管，缓慢注入碘化油和THP悬浊液，剂量为碘油0.2 ml/只和THP 2 mg/只，依据肿瘤血供情况适当增减，以栓塞至肝内动脉第2级分支为标准（图1,图2）。TACE术后1、5、10 d，分别以抽签法随机抽取7只实验兔，经耳缘静脉采集血液后过量麻醉处死，取肝脏标本，进行HE染色。对照组实验兔以相同步骤进行TACE手术，经导管注入0.2 ml生理盐水。图1, 2VX2肝癌模型组实验兔经导管肝动脉栓塞化疗（TACE) DSA图。栓塞前可见模型兔肿瘤组织染色（↑，图1），栓塞后肿瘤血管显影消失（图2）4．病理及实验室检查：采用Elisa法检测VX2肝癌模型兔TACE术前和术后血清DAO、D-LA、ALT、LPS和TLR4水平。组织标本置于固定液固定后，制成石蜡切片行HE染色。5．统计学分析：应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以 ±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。ALT、DAO与LPS两两间相关性采用Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。 图3~5对照组和VX2肝癌模型组实验兔肝脏肿瘤病例图片（HE ×200）。图3为对照组实验兔，肝细胞形态正常。图4为经导管肝动脉栓塞化疗（TACE）术后1 d，肿瘤坏死不明显。图5为TACE术后5 d，可见明显的核固缩、核分裂或解体，肿瘤组织周围可见红染的无特定形态组织图6~8实验兔外周血谷丙转氨酶（ALT）、二胺氧化酶（DAO）与脂多糖（LPS）间相关性散点图。ALT与DAO （r=0.43，P<0.01，图6），DAO与LPS（r=0.83，P<0.01，图7），ALT与LPS（r=0.64，P<0.01，图8）均呈正相关2．外周血血清检测：对照组与模型组手术前后实验兔外周血中ALT、DAO、D-LA、LPS和TLR4总体差异均有统计学意义（P<0.01，表1）。相对于对照组，模型组实验兔术前1 d外周血DAO和D-LA水平增加，术后1 d较术前1 d DAO和D-LA明显增加，术后5 d开始下降，术后10 d降至最低，且低于术前水平，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组实验兔术前1 d外周血ALT高于对照组，术后1 d较术前升高，术后5 d开始下降，术后10 d低于术后5 d，差异均有统计学意义（P<0.05）。外周血LPS和TLR4术后1 d较术前升高，术后5 d有所下降，术后10 d最低且低于术前，差异均有统计学意义（P<0.05）。 3．相关性分析：ALT与DAO呈正相关（r=0.43，P<0.01，图6），DAO与LPS呈正相关（r=0.83，P<0.01，图7），ALT与LPS呈正相关（r=0.64 ，P<0.01，图8）。 参考文献（略） 【短篇论著】兔VX2肝癌经导管肝动脉栓塞化疗术后肠道通透性 脂多糖和Toll样受体4改变的实验研究一、资料与方法
二、结果
1．HE染色：对照组肝细胞形态正常（图3）。VX2肝癌模型兔TACE术后1 d，肝脏肿瘤坏死不明显（图4），术后5 d和10 d可见明显的肿瘤细胞核固缩、核分裂或解体，肿瘤组织周围可见较多红染的无特定形态组织（图5），以术后10 d更明显。
三、讨论
肝癌患者除伴有肝脏损伤外，多伴有肠道菌群紊乱和肠道功能损伤[2]。由于肠道功能紊乱，内部菌群失调，条件致病菌增加，细菌移位以及其有毒的代谢产物都会加重肠道的损伤。DAO和D-LA能反映肠黏膜完整性和通透性，是反映肠黏膜机械屏障的完整性和损伤程度较为理想的指标，而机械屏障是肠黏膜屏障中最重要部分。DAO和D-LA可反映肠道通透性，DAO存在于哺乳动物肠黏膜上层或绒毛上层细胞中，当肠黏膜缺血、瘀血、受损时，DAO释放入血。D-LA由肠道微生物代谢裂解产生，当肠道菌群过度生长或肠黏膜屏障功能降低时，入血量迅速增加[3]。本研究结果显示，TACE术前1 d模型组实验兔的DAO与D-LA水平高于对照组，提示肝脏的病变会影响肠道的通透性。TACE是目前临床常用的不可切除肝癌的替代治疗方案，但是栓塞肿瘤供血动脉使肿瘤以及部分周边正常肝组织缺血、缺氧，导致肝细胞损伤[4,5]。同时，化疗药物也可增加非肿瘤组织的凋亡，这种肝功能损伤多在3~ 10 d内恢复[6]。肝癌治疗后是否会由于肝脏肿瘤得到有效控制，进而改善肠道的状态是目前研究的热点。本研究对肝癌模型兔进行TACE手术，发现TACE术后1 d, ALT、DAO、D-LA均高于术前，差异有统计学意义，术后5 d ALT开始下降，同时DAO和D-LA亦开始下降，TACE术后10 d，实验兔外周血的DAO与D-LA水平已低于术前，略高于对照组，提示随着随着肿瘤的控制和肝功能的代偿与恢复，肠道功能亦相应改善。本研究还发现ALT与DAO呈正相关，提示肝功能和肠道通透性具有相关性，反映了肝肠功能在疾病中的紧密联系。目前，LPS和TLR4在肿瘤的发生与发展中的作用越来越受到关注，肝病—肠道菌群紊乱—肠源性内毒素血症可形成恶性循环。Lin等[7]研究表明TLR4的配体LPS通过激活COX-2/PGE2信号轴，进而激活STAT3通路，导致肝癌细胞的增殖，增加肿瘤的耐药性和侵袭性，且这种效果呈剂量时间依赖性。Dapito等[8]和杨坤等[9]研究表明内毒素和TLR4在病理状态下的"肝肠轴"中扮演重要的致病因子。本研究结果显示实验兔TACE术后LPS和TLR4的变化趋势与DAO的变化趋势一致，术后1 d高于术前，术后5 d开始下降，术后10 d低于术前水平，且DAO与LPS水平呈正相关，从而验证了肠道通透性增加时，LPS入血增加，促进TLR4的表达。本研究结果显示肝功能（ALT）和肠道通透性（DAO、D-LA）以及LPS间具有相关性，其可能机制为：肿瘤组织侵犯、压迫正常肝组织和肝脏血管，使门静脉回流受阻，导致肠黏膜淤血水肿，肠道黏膜屏障功能降低，内毒素增加；当肿瘤的生长与增殖得到有效控制后，血液回流改善，肠黏膜屏障功能恢复。当肝脏功能异常时，其清除LPS的能力降低，LPS能够诱导多种炎症介质改变肠黏膜的结构，增加肠道的通透性，而肠道通透性增加时细菌移位，产生更多的LPS，加重LPS介导的炎症反应，从而加重肝损伤并降低肿瘤的疗效，两者互为因果。肝癌TACE术后，肿瘤控制，肝功能有所改善，对LPS等肠源性毒素的清除能力增加，肠道黏膜屏障功能改善，细菌移位及入血减少[10,11]，都使LPS降低。这意味着TACE能够通过改善肝肠循环，协同调节体内肿瘤信号通路，诱导TLR4下调，协同发挥治疗肿瘤的作用。本研究局限性：本研究建立的肝癌模型未合并肝硬化，与人类肝癌特征有所不同，未来将建立肝硬化肝癌模型。综上所述，肝癌实验兔模型经TACE治疗肿瘤得到控制以后，肝肠循环得以改善，降低循环血液中LPS含量，诱导TLR4下调，可协同发挥治疗肿瘤的作用。
