亚硫酸盐转化被誉为DNA甲基化（5mC）检测的“金标准”，非甲基化胞嘧啶C在亚硫酸盐转化过程中转变为尿嘧啶U，进而通过PCR扩增转变为胸腺嘧啶T，甲基化mC维持不变，通过高通量测序精准检测每一碱基的甲基化修饰情况。
，Alexander Meissner等通过MspI酶切基因组DNA，并跟亚硫酸盐转化相结合，通过高通量测序技术研究小鼠多能性干细胞和分化后细胞甲基化特征，建立基于“金标准”的简化基因组DNA甲基化测序技术（RRBS），相关成果发表于《自然》杂志。随后，在《方法》杂志发表技术文章，评估该技术用于人和小鼠基因组DNA甲基化研究，其检测的CG位点最高分别可达3.4M和1.5M，且检测位点主要分布于CG岛（CG Islands）区域。
表1. 不同测序读长下，人和小鼠基因组RRBS检测CG位点数量模拟统计
为进一步增加全基因组CG位点覆盖广度，特别是非CG岛区域的甲基化检测位点的覆盖数量，本公司技术团队与香港中文大学表观遗传研究国际专家陶谦教授合作，通过模拟现有十余种限制性内切酶，如HpyCH4V, AluI, BstNI, HaeIII, HpyCH4III, ApeKI, BanII, BglII, TaqαI, SphI, BamHI, BssSI和KpnI等不同组合，将原有RRBS技术进一步升级，打破MspI单一酶切技术瓶颈，建立双酶切DRRBS甲基化测序技术，相关成果发表于《BMC Genomics》上。
1. 甲基化检测位点增加显著
在相同片段选择范围和测序读长条件下，改进后的DRRBS无论在全基因组，还是在CG岛外的区域，甲基化检测位点增加至少2-3倍，见表2。
表 2.在相同条件下，RRBS和DRRBS对CG甲基化检测位点的理论统计模拟
2. 差异甲基化（DMR）筛选更精确
相对于原有RRBS检测技术，DRRBS由于对目标区域内甲基化位点检测数量显著增加，因此更能真实代表基因的甲基化水平，筛选组间差异甲基化区域更加准确，图1。
图1. DRRBS和RRBS对于相同基因（左）和相同位点（右）甲基化检测相关性比较
3. 化学氧化与酶切亚硫酸盐测序相结合，排除羟甲基化干扰
随着DNA羟甲基化（5hmC）修饰的发现，原基于亚硫酸盐转换的甲基化检测“金标准”无法区分5mC和5hmC，易基因科技与剑桥大学oxBS技术团队合作（国内唯一技术合作单位），进一步将RRBS和DRRBS跟化学氧化相结合，既可精准检测CG位点的甲基化信息，亦可结合原RRBS或DRRBS，同时检测每一位点的羟基化修饰水平，排除甲基化检测过程中羟甲基化干扰。
图2为3号染色体上1000nt区域亚硫酸盐（BS）和氧化亚硫酸盐（oxBS）检测每一CG位点修饰水平，竖线代表该染色体区域上的CG位点，竖线高低代表修饰水平高低。
图2. 亚硫酸盐和氧化亚硫酸盐甲基化检测差异及羟甲基化检测水平
参考资料：
Nature. Aug 7; 454(7205): 766–770.Methods. Jul;48(3):226-32.BMC Genomics. Jan 16;14:11Science. May 18;336(6083):934-7
文章详细链接：点击了解详情
