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【实验技术笔记】miRNA靶序列寻找及miRNA检测

时间：2019-02-28 18:38:44

文章目录

1. microRNA 的基本知识2. miRNA 的基本操作2.1 miRNA 靶序列寻找2.2.1 TargetScan2.1.2 miRBase2.2 miRNA qPCR 检测2.2.1 引物设计2.2.2 反转录

1. microRNA 的基本知识

microRNA（miRNA）是一类长度在22nt左右的小 RNA 分子，它并不编码蛋白质，因此 miRNA 与 siRNA 和 circRNA 等小 RNA 分子一样，也是一种非编码 RNA。miRNA 的生物合成：pre-miRNA 加工成短一点的 pri-miRNA，最后再加工成成熟的 miRNA。大部分路径最后得到的miRNA 成熟体的结构都一样，都是一段 22nt 左右的双链 RNA 分子。

miRNA 的作用方式：与 siRNA 类似，通过和靶基因 RNA 的碱基互补配对从而引导沉默复合体（RISC）降解 RNA 或阻碍 mRNA 翻译成蛋白质。不同的是，miRNA 主要结合在 mRNA 的 3’UTR部分。miRNA 的基本作用机制： 1、抑制蛋白翻译（4 种不同的方式）：(1) 使正在翻译的蛋白发生降解；(2) 抑制翻译延伸；(3) 使翻译过早终止（使核糖体从 RNA 上提早掉下来，没法行使翻译功能）；(4) 抑制翻译起始。2、通过不完全的 miRNA-mRNA 互补配对诱导靶 RNA 降解。3、在 mRNA 加工体或 P 体等独立细胞质位点，通过隔绝靶 mRNA 与翻译机器使其沉默。miRNA 基本作用机制的综述：Getting to the Root of miRNA-Mediated Gene Silencing. Ana Eulalio, Eric Huntzinger, and Elisa Izaurralde. Cell. . (DOI 10.1016/j.cell..12.024). 由于 miRNA 的作用机制是比较复杂的，所以在检测 miRNA 作用时，检测一下它的靶基因的RNA 水平的表达，还要检测一下靶基因的蛋白表达。miRNA 可以调控基因的表达水平，但调控方式并不需要严格的序列特异性，不需要与目的基因严格匹配。miRNA 经典的作用途径是通过与各种mRNA 的 3’ UTR进行互作，这些互作位点与 miRNA 的“seed sequence”种子序列区（通常是miRNA 5’端的第 2-7 位碱基）相匹配，所以我们在寻找 miRNA 的靶点基因时，通常是去寻找与“seed sequence”完美匹配的基因。许多 miRNA 与靶序列的结合都只是粗略的结合，并不会进行持续配对，而是会在“seed sequence”区出现凸起和摆动，这是一个动态的过程，所以在不同物种、不同细胞类型、甚至同种细胞的不同事件过程中，miRNA 的靶基因都可能是不同的，介导了各不相同的功能。所以使用不同细胞进行实验，或者使用同种细胞检测不同生物学过程时，都要考虑选择更合适的 miRNA，而不是生搬硬套。miRNA 能结合 mRNA 的 3’UTR，也能结合 mRNA 的 5’UTR，还能结合不编码蛋白的 RNA，这也就意味着 miRNA 不光能抑制编码基因（mRNA），还能抑制非编码基因。miRNA 不适合作为基因敲降的工具。一个 miRNA 可能靶向很多个基因，一个基因也可能被多个 miRNA 调控，且只有部分 RNA 能被 miRNA 调控，多数 RNA 不是直接受 miRNA 调控的。

2. miRNA 的基本操作

2.1 miRNA 靶序列寻找

2.2.1 TargetScan

TargetScan由麻省理工学院的 BenjaminLewis 等人在年开发，它通过搜索与每个 microRNA 的种子区匹配的保守位点（非保守位点也可预测）而预测 microRNA 的靶基因，提供每个 microRNA预测靶点的准确排名，排名基于进化上保守的靶定概率（PCT 得分）或抑制的预测效果（背景+得分）。

核对物种 → 填入基因名 → 填入 microRNA 名。

预测人的hsa-miR-21靶基因首先会弹出下图这个选项，这是因为 miR-21 和 miR-590种子序列相同导致的，选择第一个broadly conserved（保守的）一栏的 microRNA。

结果如下图：

点击第二行的SitesinUTR，可以看到预测的hsa-miR-21-5p与ZNF367的结合位点情况，还可以看到另外有哪些 miRNA 靶向该基因。带边框的是选中的 miRNA，下拉可以看到 miRNA 和该靶基因的具体结合位点。

8mer、7mer 的定义：

2.1.2 miRBase

miRBase除了是microRNA 序列查询的工具，也可以预测靶基因。

在右侧的Search by miRNA name or keyword一栏输入hsa-miR-21，可以获得 hsa-miR-21 的前体序列还可以分别查看其5p, 3p 成熟体序列（前体加工后靠近 5’端的或 3’端的序列），下拉在成熟 miRNA 的Predictedtargets一栏点击该 microRNA 的名字即可查看其靶基因，点击TARGETSCAN-VERT一栏可以查看是否与直接使用 TargetScan 预测的一样。

如果要做miRNA 表达，可以把成熟 miRNA 序列合成 mimics，然后转染细胞。

如果要构建载体，则需要用miRNA 的前体序列构建到含 H1 启动子的载体中，然后转染细胞。

2.2 miRNA qPCR 检测

关键点是引物设计和反转录过程

2.2.1 引物设计

由于 miRNA 只有 22nt，而qPCR 要求模板至少 80bp，因此要将 miRNA 加长，给 miRNA加一段接头，根据加的接头不同，miRNA qPCR 方法就有很多种，如茎-环法（stem-loop）。

使用软件设计引物

sRNAPrimerDB简单好用，但是服务器不稳定，可能刷不出来。

◆RTprimer(specific)是根据输入的 miRNA 序列得出的RT-PCR 引物

◆Rp是qPCR 反向引物。

◆Fp-1正向 qPCR 引物提供了多条，任选其一即可（可以先做一下引物评价）。

手动设计引物

◆原理：给 miRNA 加 stem-loop 接头，stem-loop 的部分碱基与 miRNA 互补配对，反转录后就能把 miRNA 和 stem-loop 连接起来，stem-loop 拉直后就给 miRNA 加了延长的小尾巴，再用与之适配的 qPCR 引物就能进行 qPCR 扩增。

◆ 因此设计引物时，需要设计两种引物：

① 反转录引物：具有茎换结构。

反转录引物框架：通用的 Stem-loop adaptor+miRNA 后 6 位碱基的反向互补序列

通用的 Stem-loop adaptor：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC

② qPCR 引物

qPCR 反向引物：需要特别设计。

软件设计的qPCR 正向引物的 3’端与反转录产物的互补序列（正义链）5’端是一样的，与miRNA 的 5’端也是一样的。此外，为了保持 GC 含量平衡，在qPCR 正向引物的 5’端加了一些碱基（软件的优势，可以自动计算并加上一些碱基）。qPCR 反向引物：与反转录产物的互补序列的 3’端互补配对，且与 stem-loop 的 5’端一样。stem-loop 是通用的，所以反向引物也是通用的：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-3'。