本发明涉及污水治理
技术领域：
，具体涉及一种固体复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：随着工业经济的发展，越来越多的氮元素进入水环境中，甚至引起水体富营养化，严重影响人类的生存环境。目前的生物脱氮工艺主要依靠自养硝化菌在好氧条件下将氨氮进行硝化作用，然后通过反硝化菌在缺氧条件下进行反硝化，将硝态氮、亚硝态氮转化为氮气，传统的工艺将硝化作用和反硝化作用分别在两个反应器中进行，占地面积大，工艺流程复杂，运行费用高。与自养硝化菌相比，异养硝化菌具有生长速率快、活性高、环境适应性强等优点，可同步进行有机物降解、硝化和反硝化，可在同一个容器中实现脱氮作用，大大减少占地面积和运行费用。目前，国内外对异养硝化-好氧反硝化菌的研究尚处于实验室阶段，且主要是针对纯菌进行研究，针对复合菌的研究较少，而复合菌在实际中更能承受环境变化，更有应用价值。目前异养硝化好氧反硝化菌种主要是液体产品，固体产品相对较少，液体产品保存时间短，运输困难。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种固体复合菌剂的制备方法，在污水源地收集样品制备原菌液，确保原菌液中菌种的丰富度，将原菌液进行富集培养，接种至反应器中进行扩大培养，确保菌种具有较高浓度和良好的活性，同时，也使菌种具有很强的环境适应能力，在强碱、高温条件下仍具有高活性，将异养硝化好氧反硝化复合菌液离心，去除上清液，加入干燥保护剂和辅料混合造粒，制得固体复合菌剂，适用范围广，在极端条件下依然能够快速繁殖，发挥作用，而且可同步进行硝化和反硝化，减少设备投入，降解效果好。本发明的目的通过以下技术方案实现：一种固体复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：步骤(a)：在污水源地收集样品加入无菌水震荡培养得到原菌液；步骤(b)：将原菌液加入富集培养基中富集培养得到异养硝化好氧反硝化复合菌原液；步骤(c)：将异养硝化好氧反硝化复合菌原液接种至反应器中，加入液体培养基进行扩大培养，得到异养硝化好氧反硝化复合菌液；步骤(d)：将异养硝化好氧反硝化复合菌液离心，去除上清液，加入干燥保护剂搅拌混合，得到菌浆；步骤(e)：将菌浆与辅料混合造粒，制得固体复合菌剂。本发明的一种固体复合菌剂的制备方法，在污水源地收集样品制备原菌液，确保原菌液中菌种的丰富度，将原菌液进行富集培养，接种至反应器中进行扩大培养，使菌种具有较高浓度和良好的活性，同时，也使菌种具有很强的环境适应能力，在强碱、高温条件下仍具有高活性，将异养硝化好氧反硝化复合菌液离心，去除上清液，加入干燥保护剂和辅料混合造粒，制得固体复合菌剂，适用范围广，在极端条件下依然能够快速繁殖，发挥作用，而且可同步进行硝化和反硝化，减少设备投入，降解效果好，更具有应用价值，便于运输保存。其中，所述步骤(c)中扩大培养依次包括步骤(c1)制备一级种子液、步骤(c2)制备二级种子液和步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液，制备一级种子液的具体步骤包括将异养硝化好氧反硝化复合菌原液加入反应器中添加液体培养基，控制温度32-35℃，ph7.0-7.5，转速120-160rpm，培养时间15-20h，直到菌种浓度为4.0-6.0×1010cfu/ml，即得一级种子液；所述步骤(c1)制备一级种子液之后还包括步骤(c2)制备二级种子液，制备二级种子液的具体步骤包括将一级种子液接种到一级反应器中添加液体培养基，控制温度32-35℃，ph7.0-7.5，反应压力0.5-1.5mpa，溶解氧浓度为20-40％，通气比0.8-1.5，直到菌种浓度为7.0-9.0×1010cfu/ml，即得二级种子液；步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液的具体步骤包括将二级种子液接种到二级反应器中添加液体培养基，控制温度32-35℃，ph7.0-7.5，反应压力0.5-1.5mpa，溶解氧浓度为20-40％，通气比0.8-1.5，直到菌种浓度为1.0-2.0×1011cfu/ml，即得异养硝化好氧反硝化复合菌液。异养硝化好氧反硝化复合菌原液在液体培养基的作用下进行扩大培养，能够使菌种进行定向繁殖，菌种浓度得到提升，菌种丰富度得到保存以及菌种的降解特性得到提高。具体地，将异养硝化好氧反硝化复合菌原液分三步进行扩大培养，逐步增加菌浓，而且每步控制不同的反应条件，使菌种能够快速、高效地生产繁殖，最终得到菌种浓度为1.0-2.0×1011cfu/ml的异养硝化好氧反硝化复合菌液。控制特定范围值的温度、酸碱度、转速和培养时间，能够使复合菌种能够协同生长繁殖，使复合菌种能够快速地增加菌种浓度。其中，所述步骤(b)中富集培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona2.0-6.0g/l，(nh4)2so40.05～5.0g/l，kh2po40.01-0.5g/l，mgso4·7h2o0.1-1g/l，nacl10.0-20.0g/l，微量元素0.1-2ml，溶剂为水。使用含有硫酸铵的富集培养基进行富集培养，异养硝化好氧反硝化复合菌液中菌种利用硫酸铵作用氮源进行生长繁殖，确保菌剂的降解特性。其中，所述步骤(b)中驯化培养具体步骤为：将原菌液加入富集培养基中震荡培养，并按浓度梯度提高富集培养基中硫酸铵的浓度。震荡培养时，设置氨氮浓度为2mg/l，当检测到富集培养基中氨氮降解率≥90％，总氮降解率≥90％时，取上一浓度的菌液接种至下一浓度中，设置氨氮浓度为10mg/l，如此多次培养，直到氨氮浓度为600mg/l，使菌种达到驯化培养的效果。具体地，氨氮浓度梯度设置为：2mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l。设置多个浓度梯度能够保持并提高菌种对氨氮的降解能力。氨氮浓度为培养基中铵根离子的浓度，铵根离子的浓度与硫酸铵的浓度可根据实际使用摩尔量进行换算。其中，所述步骤(c)中液体培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona2～10g/l，(nh4)2so40.05～5.0g/l，nano30.05～5.0g/l，nano20.05～5.0g/l，kh2po40.01～2g/l，mgso4·7h2o0.05～1g/l，nacl5～20g/l，微量元素0.5～2ml/l，溶剂为水。液体培养基包括(nh4)2so4、nano3、nano2等多种氨氮化合物，能够进一步提高菌种对氨氮、硝态氮和亚硝态氮的降解能力，同时还包括多种元素，提供复合菌种的生长繁殖。其中，所述干燥保护剂为半乳糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、棉籽糖、甘油、二甲亚砜、明胶中的至少一种。干燥保护剂能够为复合菌种提供适合的环境，保证菌种的活性，提高复合菌种的环境适用能力。其中，所述辅料为草木灰、蛭石粉、高岭土、硅藻土、黏土、硬脂酸镁中的至少一种。辅料能够使菌浆固定粘合形成固体颗粒，便于保存使用和运输。本发明的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种固体复合菌剂，所述固体复合菌剂由上述制备方法制备而成。本发明的固体复合菌剂具有优异的硝化活力和反硝化活力，能够同步进行硝化和反硝化，无需设置厌氧或缺氧池就能实现水体中总氮的去除，减少建设和运行成本，可广泛用于处理各种含氮废水中，菌种的环境适用能力强，在强碱、高温条件下仍然具有高活性。本发明的再一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种固体复合菌剂的应用，将上述固体复合菌剂投入含氮废水中，控制温度10～40℃，ph为6～11。使用时，将固体复合菌剂投入废水中即可，菌种环境适应能力强，使用方便，而且菌种的降解速度快，降解效果好。使用时，投加0.005-0.05％的菌种量即可达到良好的去除率，使氨氮去除率95％以上，硝态氮的去除率为95％以上，亚硝态氮的去除率为88％以上，总氮的去除率为90％以上，c/n为5～15。本发明的有益效果：1、本发明的一种固体复合菌剂的制备方法，在污水源地收集样品制备原菌液，确保原菌液中菌种的丰富度，将原菌液进行富集培养，接种至反应器中进行扩大培养，确保菌种具有较高浓度和良好的活性，同时，也使菌种具有很强的环境适应能力，在强碱、高温条件下仍具有高活性，将异养硝化好氧反硝化复合菌液离心，去除上清液，加入干燥保护剂和辅料混合造粒，制得固体复合菌剂，适用范围广，在极端条件下依然能够快速繁殖，发挥作用，而且可同步进行硝化和反硝化，减少设备投入，降解效果好。2、本发明的一种固体复合菌剂的制备方法制备的复合菌剂应用在含氮污水处理领域，复合菌剂包括10-70份粪产碱菌、10-30份发酵纤维单胞菌、5-20份缺陷短波单胞菌、3-10份螯台球菌、1-5份拟杆菌、0.5-3份水微菌、0.2-2份乔治亚菌、0.1-1.5份德沃斯氏菌、0.05-0.5份代尔夫特菌。本发明将上述异氧硝化好氧反硝化菌种进行发酵培养，使之形成一定比例进行组合，在发挥各菌种功能的同时，并使不同菌种优势互补，不仅有效除去废水中的氨氮、硝态氮、亚硝态氮和总氮，还可以适合各种复杂水体和环境。本发明的复合菌生长范围为10～40℃，适宜盐分为0.5～10％，适宜ph为5～11，特别的，在碱性条件下生长更好。菌落直径为0.1～10mm，呈黄色或乳白色。细菌呈球状或杆状。3、本发明的一种固体复合菌剂的应用，将固体复合菌剂投入含氮废水中，控制温度和酸碱度，使固体复合菌剂中的菌种对废水进行降解，由于复合菌剂中包括多种不同的菌种，可同时降解氨氮、硝态氮、亚硝态氮和总氮。投放时，控制每升含氮废水中投加重量份数为0.005～0.05％的固体复合菌剂，c/n为5～15，即可使氨氮去除率达到95％以上，硝态氮的去除率达到95％以上，亚硝态氮的去除率达到88％以上，总氮的去除率达到90％以上。具体实施方式结合以下实施例以及图表对本发明作进一步描述。实施例1一种固体复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：步骤(a)：在污水源地收集样品加入无菌水震荡培养得到原菌液；步骤(b)：将原菌液加入富集培养基中富集培养得到异养硝化好氧反硝化复合菌原液；步骤(c)：将异养硝化好氧反硝化复合菌原液接种至反应器中，加入液体培养基进行扩大培养，得到异养硝化好氧反硝化复合菌液；步骤(d)：将异养硝化好氧反硝化复合菌液离心，去除上清液，加入干燥保护剂搅拌混合，得到菌浆；步骤(e)：将菌浆与辅料混合造粒，制得固体复合菌剂。其中，所述步骤(a)中，取污水处理厂二沉池污泥、富营养化湖泊水样及其底泥按照1:1:1的比例混合，取10ml加入到50ml无菌水中，于35℃，180rpm震荡培养15h，获得原菌液。其中，所述步骤(c)中扩大培养包括步骤(c1)制备一级种子液、步骤(c2)制备二级种子液和步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液，制备一级种子液的具体步骤包括将异养硝化好氧反硝化复合菌原液加入反应器中添加液体培养基，控制温度32℃，ph7.0，转速120rpm，培养时间15h，直到菌种浓度为4.0×1010cfu/ml，即得一级种子液；所述步骤(c1)制备一级种子液之后还包括步骤(c2)制备二级种子液，制备二级种子液的具体步骤包括将一级种子液接种到一级反应器中添加液体培养基，控制温度32℃，ph7.0，反应压力0.5mpa，溶解氧浓度为20％，通气比1.2，直到菌种浓度为7.0×1010cfu/ml，即得二级种子液；步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液的具体步骤包括将二级种子液接种到二级反应器中添加液体培养基，控制温度32℃，ph7.0，反应压力0.5mpa，溶解氧浓度为20％，通气比0.8，直到菌种浓度为1.0×1011cfu/ml，即得异养硝化好氧反硝化复合菌液。其中，所述步骤(b)中富集培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona2.0g/l，(nh4)2so40.05g/l，kh2po40.01g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，nacl10.0g/l，微量元素0.1ml，溶剂为水。其中，所述步骤(b)中驯化培养具体步骤为：将原菌液加入富集培养基中震荡培养，并按浓度梯度提高富集培养基中硫酸铵的浓度。根据步骤(b)中硫酸铵的浓度换算为氨氮浓度得到，氨氮浓度梯度设置为：2mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l。其中，所述步骤(c)中液体培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona2g/l，(nh4)2so40.05g/l，nano30.05g/l，nano20.05g/l，kh2po40.01g/l，mgso4·7h2o0.05g/l，nacl5g/l，微量元素0.5ml/l，溶剂为水。其中，所述干燥保护剂包括下列重量份数的原料：半乳糖2份、海藻糖1份、二甲亚砜2份、明胶1份。其中，所述辅料包括下列重量份数的原料：草木灰2份、蛭石粉1份、高岭土1份、硅藻土1份。步骤(c)所得的异养硝化好氧反硝化复合菌液经鉴定为革兰氏阴性菌，含有芽孢，适宜生长温度范围为10～40℃，适宜盐分为0.5～10％，适宜ph为5～11，特别的，在碱性条件下生长更好。将获得的异养硝化好氧反硝化复合菌在固体培养基中进行培养，得到四种不同菌落，菌落情况见表1。表1异样硝化好氧反硝化复合菌的菌落情况从富集获得的菌种中取菌液200μl，用dna提取试剂盒进行总dna的提取，dna提取后，用通用引物338f(5"-actcctacgggaggcagc-3")和806r(5"-ggactachvgggtwtctaat-3")对16srdna的v3-v4区域进行pcr扩增，利用illuminamiseq高通量测序平台进行pcr产物的测序和分析，测序结果用blast软件与genbank数据库中已有的16srdna序列进行相似性对比，获得异样硝化好氧反硝化复合菌由65％alcaligenes粪产碱菌，15％actinotalea发酵纤维单胞菌，10％brevundimonas缺陷短波单胞菌，5％chelatococcus螯台球菌，2.5％bacteroides拟杆菌，1.5％aquamicrobium水微菌，0.6％georgenia乔治亚菌、0.31％devosia德沃斯氏菌，0.09％delftia代尔夫特菌。实施例2一种固体复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：步骤(a)：在污水源地收集样品加入无菌水震荡培养得到原菌液；步骤(b)：将原菌液加入富集培养基中富集培养得到异养硝化好氧反硝化复合菌原液；步骤(c)：将异养硝化好氧反硝化复合菌原液接种至反应器中，加入液体培养基进行扩大培养，得到异养硝化好氧反硝化复合菌液；步骤(d)：将异养硝化好氧反硝化复合菌液离心，去除上清液，加入干燥保护剂搅拌混合，得到菌浆；步骤(e)：将菌浆与辅料混合造粒，制得固体复合菌剂。其中，所述步骤(a)中，取污水处理厂二沉池污泥、富营养化湖泊水样及其底泥按照1:1:1的比例混合，取10ml加入到50ml无菌水中，于35℃，180rpm震荡培养15h，获得原菌液。其中，所述步骤(c)中扩大培养包括步骤(c1)制备一级种子液、步骤(c2)制备二级种子液和步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液，制备一级种子液的具体步骤包括将异养硝化好氧反硝化复合菌原液加入反应器中添加液体培养基，控制温度34℃，ph7.2，转速130rpm，培养时间16h，直到菌种浓度为4.5×1010cfu/ml，即得一级种子液；所述步骤(c1)制备一级种子液之后还包括步骤(c2)制备二级种子液，制备二级种子液的具体步骤包括将一级种子液接种到一级反应器中添加液体培养基，控制温度34℃，ph7.2，反应压力0.8mpa，溶解氧浓度为25％，通气比1.4，直到菌种浓度为7.5×1010cfu/ml，即得二级种子液；步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液的具体步骤包括将二级种子液接种到二级反应器中添加液体培养基，控制温度33℃，ph7.2，反应压力0.7mpa，溶解氧浓度为28％，通气比0.9，直到菌种浓度为1.3×1011cfu/ml，即得异养硝化好氧反硝化复合菌液。其中，所述步骤(b)中富集培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona3.0g/l，(nh4)2so40.09g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，nacl13.0g/l，微量元素0.3ml，溶剂为水。其中，所述步骤(b)中驯化培养具体步骤为：将原菌液加入富集培养基中震荡培养，并按浓度梯度提高富集培养基中硫酸铵的浓度。根据步骤(b)中硫酸铵的浓度换算为氨氮浓度得到，氨氮浓度梯度设置为：2mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l。其中，所述步骤(c)中液体培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona4g/l，(nh4)2so41.1g/l，nano31.2g/l，nano20.9g/l，kh2po41.2g/l，mgso4·7h2o1.2g/l，nacl7g/l，微量元素0.8ml/l，溶剂为水。其中，所述干燥保护剂包括下列重量份数的原料：蔗糖4份、海藻糖4份、二甲亚砜4份、明胶3份。其中，所述辅料包括下列重量份数的原料：草木灰4份、高岭土3份、黏土2份。实施例3一种固体复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：步骤(a)：在污水源地收集样品加入无菌水震荡培养得到原菌液；步骤(b)：将原菌液加入富集培养基中富集培养得到异养硝化好氧反硝化复合菌原液；步骤(c)：将异养硝化好氧反硝化复合菌原液接种至反应器中，加入液体培养基进行扩大培养，得到异养硝化好氧反硝化复合菌液；步骤(d)：将异养硝化好氧反硝化复合菌液离心，去除上清液，加入干燥保护剂搅拌混合，得到菌浆；步骤(e)：将菌浆与辅料混合造粒，制得固体复合菌剂。其中，所述步骤(a)中，取污水处理厂二沉池污泥、富营养化湖泊水样及其底泥按照1:1:1的比例混合，取10ml加入到50ml无菌水中，于35℃，180rpm震荡培养15h，获得原菌液。其中，所述步骤(c)中扩大培养包括步骤(c1)制备一级种子液、步骤(c2)制备二级种子液和步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液，制备一级种子液的具体步骤包括将异养硝化好氧反硝化复合菌原液加入反应器中添加液体培养基，控制温度33℃，ph7.3，转速140rpm，培养时间17.5h，直到菌种浓度为5.0×1010cfu/ml，即得一级种子液；所述步骤(c1)制备一级种子液之后还包括步骤(c2)制备二级种子液，制备二级种子液的具体步骤包括将一级种子液接种到一级反应器中添加液体培养基，控制温度35℃，ph7.3，反应压力1.0mpa，溶解氧浓度为30％，通气比1.5，直到菌种浓度为8.0×1010cfu/ml，即得二级种子液；步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液的具体步骤包括将二级种子液接种到二级反应器中添加液体培养基，控制温度33℃，ph7.3，反应压力1.0mpa，溶解氧浓度为30％，通气比1.0，直到菌种浓度为1.5×1011cfu/ml，即得异养硝化好氧反硝化复合菌液。其中，所述步骤(b)中富集培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona4.0g/l，(nh4)2so43.0g/l，kh2po40.3g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，nacl15.0g/l，微量元素1.0ml，溶剂为水。其中，所述步骤(b)中驯化培养具体步骤为：将原菌液加入富集培养基中震荡培养，并按浓度梯度提高富集培养基中硫酸铵的浓度。根据步骤(b)中硫酸铵的浓度换算为氨氮浓度得到，氨氮浓度梯度设置为：2mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l。其中，所述步骤(c)中液体培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona6g/l，(nh4)2so42.5g/l，nano32.5g/l，nano22.5g/l，kh2po41.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，nacl12.5g/l，微量元素1.25ml/l，溶剂为水。其中，所述干燥保护剂包括下列重量份数的原料：棉籽糖2.5份、海藻糖1.5份、二甲亚砜3.5份、甘油2份。其中，所述辅料包括下列重量份数的原料：草木灰3.5份、硬脂酸镁1.5份、高岭土2份、硅藻土1.5份。实施例4一种固体复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：步骤(a)：在污水源地收集样品加入无菌水震荡培养得到原菌液；步骤(b)：将原菌液加入富集培养基中富集培养得到异养硝化好氧反硝化复合菌原液；步骤(c)：将异养硝化好氧反硝化复合菌原液接种至反应器中，加入液体培养基进行扩大培养，得到异养硝化好氧反硝化复合菌液；步骤(d)：将异养硝化好氧反硝化复合菌液离心，去除上清液，加入干燥保护剂搅拌混合，得到菌浆；步骤(e)：将菌浆与辅料混合造粒，制得固体复合菌剂。其中，所述步骤(a)中，取污水处理厂二沉池污泥、富营养化湖泊水样及其底泥按照1:1:1的比例混合，取10ml加入到50ml无菌水中，于35℃，180rpm震荡培养15h，获得原菌液。其中，所述步骤(c)中扩大培养包括步骤(c1)制备一级种子液、步骤(c2)制备二级种子液和步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液，制备一级种子液的具体步骤包括将异养硝化好氧反硝化复合菌原液加入反应器中添加液体培养基，控制温度34.5℃，ph7.4，转速150rpm，培养时间18h，直到菌种浓度为5.6×1010cfu/ml，即得一级种子液；所述步骤(c1)制备一级种子液之后还包括步骤(c2)制备二级种子液，制备二级种子液的具体步骤包括将一级种子液接种到一级反应器中添加液体培养基，控制温度34.5℃，ph7.4，反应压力1.3mpa，溶解氧浓度为38％，通气比1.4，直到菌种浓度为8.5×1010cfu/ml，即得二级种子液；步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液的具体步骤包括将二级种子液接种到二级反应器中添加液体培养基，控制温度34℃，ph7.4，反应压力1.2mpa，溶解氧浓度为38％，通气比1.2，直到菌种浓度为1.8×1011cfu/ml，即得异养硝化好氧反硝化复合菌液。其中，所述步骤(b)中富集培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona5.0g/l，(nh4)2so44.2g/l，kh2po40.38g/l，mgso4·7h2o0.84g/l，nacl18.5g/l，微量元素1.7ml，溶剂为水。其中，所述步骤(b)中驯化培养具体步骤为：将原菌液加入富集培养基中震荡培养，并按浓度梯度提高富集培养基中硫酸铵的浓度。根据步骤(b)中硫酸铵的浓度换算为氨氮浓度得到，氨氮浓度梯度设置为：2mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l。其中，所述步骤(c)中液体培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona8.5g/l，(nh4)2so44.2g/l，nano34.5g/l，nano23.9g/l，kh2po41.8g/l，mgso4·7h2o0.8g/l，nacl18.5g/l，微量元素1.6ml/l，溶剂为水。其中，所述干燥保护剂包括下列重量份数的原料：蔗糖4份、海藻糖4份、二甲亚砜4份、明胶3份。其中，所述辅料包括下列重量份数的原料：草木灰4份、蛭石粉3份、高岭土3份、黏土2份。实施例5一种固体复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：步骤(a)：在污水源地收集样品加入无菌水震荡培养得到原菌液；步骤(b)：将原菌液加入富集培养基中富集培养得到异养硝化好氧反硝化复合菌原液；步骤(c)：将异养硝化好氧反硝化复合菌原液接种至反应器中，加入液体培养基进行扩大培养，得到异养硝化好氧反硝化复合菌液；步骤(d)：将异养硝化好氧反硝化复合菌液离心，去除上清液，加入干燥保护剂搅拌混合，得到菌浆；步骤(e)：将菌浆与辅料混合造粒，制得固体复合菌剂。其中，所述步骤(a)中，取污水处理厂二沉池污泥、富营养化湖泊水样及其底泥按照1:1:1的比例混合，取10ml加入到50ml无菌水中，于35℃，180rpm震荡培养15h，获得原菌液。其中，所述步骤(c)中扩大培养包括步骤(c1)制备一级种子液、步骤(c2)制备二级种子液和步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液，制备一级种子液的具体步骤包括将异养硝化好氧反硝化复合菌原液加入反应器中添加液体培养基，控制温度35℃，ph7.5，转速160rpm，培养时间20h，直到菌种浓度为6.0×1010cfu/ml，即得一级种子液；所述步骤(c1)制备一级种子液之后还包括步骤(c2)制备二级种子液，制备二级种子液的具体步骤包括将一级种子液接种到一级反应器中添加液体培养基，控制温度35℃，ph7.5，反应压力1.5mpa，溶解氧浓度为40％，通气比1.5，直到菌种浓度为9.0×1010cfu/ml，即得二级种子液；步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液的具体步骤包括将二级种子液接种到二级反应器中添加液体培养基，控制温度35℃，ph7.5，反应压力1.5mpa，溶解氧浓度为40％，通气比0.9，直到菌种浓度为2.0×1011cfu/ml，即得异养硝化好氧反硝化复合菌液。其中，所述步骤(b)中富集培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona6.0g/l，(nh4)2so45.0g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o1g/l，nacl20.0g/l，微量元素2ml，溶剂为水。其中，所述步骤(b)中驯化培养具体步骤为：将原菌液加入富集培养基中震荡培养，并按浓度梯度提高富集培养基中硫酸铵的浓度。根据步骤(b)中硫酸铵的浓度换算为氨氮浓度得到，氨氮浓度梯度设置为：2mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l。其中，所述步骤(c)中液体培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona10g/l，(nh4)2so45.0g/l，nano35.0g/l，nano25.0g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o1g/l，nacl20g/l，微量元素2ml/l，溶剂为水。其中，所述干燥保护剂包括下列重量份数的原料：半乳糖5份、海藻糖4份、二甲亚砜5份、明胶3份。其中，所述辅料包括下列重量份数的原料：草木灰5份、蛭石粉4份、高岭土3份、硅藻土2份。异养硝化好氧反硝化复合菌的应用测试应用测试一：将实施二～四制备得到的异养硝化好氧反硝复合菌剂固体产品投放到含氮废水中，菌种投加量为0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05％，所述含氮废水由ch3coona4.0g/l，(nh4)2so40.167g/l，nano20.24g/l，kno30.164g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，nacl15.0g/l，ph7.4，温度为35℃，反应6h后各指标的变化见表1、表2和表3表1实施例二复合菌不同投加量对含氮废水的去除效果投加量％氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％0.00596.196.292.393.20.0196.897.896.595.80.0298.498.698.799.00.0399.999.899.899.80.0499.899.999.999.90.0599.899.999.999.9表2实施例三复合菌不同投加量对含氮废水的去除效果投加量％氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％0.00595.195.288.690.50.0196.296.896.596.10.0297.497.297.597.30.0398.598.698.398.40.0498.298.398.398.30.0598.598.498.498.4表3实施例四复合菌不同投加量对含氮废水的去除效果投加量％氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％0.00595.295.489.591.20.0196.497.196.996.80.0297.897.697.897.70.0398.998.999.098.90.0498.998.098.998.90.0599.098.999.099.0由表1-表3可以得到，使用本发明的固定化复合菌剂对含氮废水进行治理时，投加量为0.005-0.05％时，均具有较好的降解效果，当投加量为0.03％，对氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和总氮均具有很好的降解效果，而且去除率均为98％以上。应用测试二：与应用测试一不同的是，菌种投加量为0.03％，温度设置为10、20、30、35、40℃，反应6h后各指标的变化见表4、表5和表6。表4实施例二复合菌不同温度下对含氮废水的去除效果温度℃氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％1095.695.991.892.92096.497.596.196.53098.998.798.798.83599.999.899.899.84099.699.199.099.2表5实施例三复合菌不同温度下对含氮废水的去除效果温度℃氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％1095.095.088.190.32096.196.295.795.93097.097.097.197.03598.598.698.398.44098.097.897.597.9表6实施例四复合菌不同温度下对含氮废水的去除效果温度℃氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％1095.195.289.091.02096.196.796.196.23097.897.497.297.43598.998.999.098.94098.097.598.198.2由表4-表6可得，本发明制备的固定化复合菌剂在温度为10-40℃时均具有良好的去除效果。应用测试三：与应用测试二不同的是，本实施例温度为35℃，ph设置为6、7、8、9、10、11，反应6h后各指标的变化见表7、表8和表9表7实施例二复合菌不同ph下对含氮废水的去除效果ph氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％696.196.794.896.1799.999.899.899.8899.899.899.999.8998.999.498.999.21099.599.199.099.21199.098.798.698.7表8实施例三复合菌不同ph下对含氮废水的去除效果ph氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％698.598.698.398.4798.398.498.098.1897.196.897.097.0996.896.796.896.71096.496.596.496.41196.195.796.096.0表9实施例四复合菌不同ph下对含氮废水的去除效果ph氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％695.195.189.289.0796.096.196.096.0897.497.097.097.1998.898.599.098.81098.998.999.098.91198.698.999.198.9由表7-表9可得，本发明制备的固定化复合菌剂在ph为6-11时均具有良好的降解效果。应用测试四：与应用测试三不同的是，本实施例菌种投加量为0.03％，c/n设置为5、7、9、11、13、15，反应6h后各指标的变化见表10、表11和表12。表10实施例二复合菌不同c/n下对含氮废水的去除效果c/n氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％596.196.792.395.1796.296.892.895.8997.097.593.896.81199.899.699.899.81399.899.899.999.81599.999.999.999.9表11实施例三复合菌不同c/n下对含氮废水的去除效果c/n氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％596.096.192.094.2796.096.292.195.0996.597.093.296.21199.199.199.099.11399.299.399.299.21599.299.499.499.4表12实施例四复合菌不同c/n下对含氮废水的去除效果c/n氨氮％硝酸盐氮％亚硝酸盐氮％总氮％596.296.392.294.5796.496.592.395.5996.897.293.796.71199.299.399.299.21399.499.599.599.51599.599.799.699.6由表10-表12可得，本发明制备的固定化复合菌剂在c/n为5-15时，均具有良好的去除效果。应用测试五：将实施例二获得的异养硝化好氧反硝复合菌剂产品，按照投加量0.03％投放于不同废水中，反应24h，各指标变化见表13。表13实施例二复合菌对不同废水的处理效果由表13可得，本发明制备的固定化复合菌剂对不同的含氮污水均具有良好的去除效果，而且去除率高。复合菌种性能测试(1)性能测试实验1-4：取1ml实施例2制备得到的异养硝化好氧反硝化复合菌液在无菌条件下接入灭菌后的lb液体培养基，于35℃，180rpm振荡培养24h，使得复合菌的菌含量为5.0×108cfu/ml，将扩培后的菌种用生理盐水离心清洗2次后，将菌体转入相应铵盐培养基、硝酸盐培养基、亚硝酸盐培养基和混合氮培养基中，于35℃，180rpm振荡培养。每隔1h取样检测各个培养基中的氨氮、总氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮浓度的变化。铵盐培养基(g/l)：ch3coona4.0，(nh4)2so40.5，kh2po40.1，mgs04·7h2o0.5，nacl15.0，微量元素1ml，ph7.2～7.4。硝酸盐培养基(g/l)：ch3coona4.0，kno30.5，kh2po40.1，mgso4·7h2o0.5，nacl15.0，微量元素1ml，ph7.2～7.4。亚硝酸盐培养基(g/l)：ch3coona4.0，nano20.5，kh2po40.1，mgso4·7h2o0.5，nacl15.0，微量元素1ml，ph7.2～7.4。混合氮培养基(g/l)：ch3coona4.0，(nh4)2so40.2，nano20.2，kno30.2，kh2po40.1，mgso4·7h2o0.5，nacl15.0，微量元素1ml，ph7.2～7.4。四个实验组中氨氮、硝氮、亚硝氮、总氮浓度随时间变化见表14、表15、表16和表17。表14以氨氮为唯一氮源时氮浓度的变化反应时间h氨氮(mg/l)硝酸盐氮(mg/l)亚硝酸盐氮(mg/l)总氮(mg/l)0101.100100156.320.010.00157.12226.120.005027.1312.340012.4642.31002.3851.21001.2360.3000.41表15以硝酸盐氮为唯一氮源时氮浓度的变化反应时间h氨氮(mg/l)硝酸盐氮(mg/l)亚硝酸盐氮(mg/l)总氮(mg/l)00.0198.60.0299.110.00546.10.0147.3.50.00120.1305.105.2402.302.3501.201.3600.100.12表16以亚硝酸盐氮为唯一氮源时氮浓度的变化反应时间h氨氮(mg/l)硝酸盐氮(mg/l)亚硝酸盐氮(mg/l)总氮(mg/l)000.00595.395.4100.00141.241.520019.619.83006.16.14001.21.35000.120.1360000.01表17以混合氮为唯一氮源时氮浓度的变化反应时间h氨氮(mg/l)硝酸盐氮(mg/l)亚硝酸盐氮(mg/l)总氮(mg/l)032.635.23199.1112.313.410.236.123.82.52.79.231.21.61.9540.50.70.41.850.10.130.050.360.030.040.010.09传统生物脱氮认为氮在生物转化须经过氨化、硝化和反硝化几步完成，在好氧条件下，自养硝化菌经硝化作用将氨氮转化为硝态氮和亚硝态氮，厌氧条件下，反硝化菌经反硝化作用将硝态氮转化为氮气实现脱氮目的。由表14-17可得，本发明涉及的异样硝化好氧反硝化复合菌既有良好的硝化作用，也可同时利用硝态氮和氧气作为电子受体进行好氧反硝化，在实际中可在同一个反应器中实现硝化和反硝化作用，更有应用价值，无论以氨氮、硝酸盐氮还是混合氮为单一氮源时都能够高效地进行降解，而且反应6小时后的降解率达到99％以上。(2)性能测试实验5：取实施例2制得的异氧硝化好氧反硝化复合菌液在无菌条件下接入灭菌后的lb液体培养基，于35℃，180rpm振荡培养24h，使得复合菌的菌含量为5.0×108cfu/ml，将扩培后的菌种用生理盐水离心清洗2次后，将菌体转入相应以葡萄糖为碳源的铵盐培养基中，于35℃，180rpm振荡培养，反应6h后氨氮、总氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮浓度的变化见表6。表18以葡萄糖为碳源时氮元素的变化氨氮(mg/l)硝酸盐氮(mg/l)亚硝酸盐氮(mg/l)总氮(mg/l)反应前100.200100.3反应后1.2001.24(3)性能测试实验6：与测试实验5不同的是，铵盐培养基中以柠檬酸三钠为碳源，反应6h后氨氮、总氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮浓度的变化见表19。表19以柠檬酸三钠为碳源时氮元素的变化由表18和表19可得，本发明制备的异养硝化好氧反硝化复合菌可利用葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸三钠其中的一种或几种作为碳源生长繁殖，而且对氨氮的降解率仍然高达98.6％以上。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页1 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技术特征：
1.一种固体复合菌剂的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤(a)：在污水源地收集样品加入无菌水震荡培养得到原菌液；
步骤(b)：将原菌液加入富集培养基中富集培养得到异养硝化好氧反硝化复合菌原液；
步骤(c)：将异养硝化好氧反硝化复合菌原液接种至反应器中，加入液体培养基进行扩大培养，得到异养硝化好氧反硝化复合菌液；
步骤(d)：将异养硝化好氧反硝化复合菌液离心，去除上清液，加入干燥保护剂搅拌混合，得到菌浆；
步骤(e)：将菌浆与辅料混合造粒，制得固体复合菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种固体复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(c)中扩大培养依次包括步骤(c1)制备一级种子液、步骤(c2)制备二级种子液和步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液，制备一级种子液的具体步骤包括将异养硝化好氧反硝化复合菌原液加入反应器中，添加液体培养基进行培养，直到菌种浓度为4.0-6.0×1010cfu/ml，即得一级种子液；所述步骤(c1)制备一级种子液之后还包括步骤(c2)制备二级种子液，制备二级种子液的具体步骤包括将一级种子液接种到一级反应器中，添加液体培养基进行培养，直到菌种浓度为7.0-9.0×1010cfu/ml，即得二级种子液；步骤(c3)制备异养硝化好氧反硝化复合菌液的具体步骤包括将二级种子液接种到二级反应器中，添加液体培养基，直到菌种浓度为1.0-2.0×1011cfu/ml，即得异养硝化好氧反硝化复合菌液。
3.根据权利要求1所述的一种固体复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)中富集培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona2.0-6.0g/l，(nh4)2so40.05～5.0g/l，kh2po40.01-0.5g/l，mgso4·7h2o0.1-1g/l，nacl10.0-20.0g/l，微量元素0.1-2ml，溶剂为水。
4.根据权利要求3所述的一种固体复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)中驯化培养具体步骤为：将原菌液加入富集培养基中震荡培养，并按浓度梯度提高富集培养基中硫酸铵的浓度。
5.根据权利要求1所述的一种固体复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(c)中液体培养基由以下浓度的原料组成：ch3coona2～10g/l，(nh4)2so40.05～5.0g/l，nano30.05～5.0g/l，nano20.05～5.0g/l，kh2po40.01～2g/l，mgso4·7h2o0.05～1g/l，nacl5～20g/l，微量元素0.5～2ml/l，溶剂为水。
6.根据权利要求1所述的一种固体复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述干燥保护剂为半乳糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、棉籽糖、甘油、二甲亚砜、明胶中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的一种固体复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述辅料为草木灰、蛭石粉、高岭土、硅藻土、黏土、硬脂酸镁中的至少一种。
8.一种固体复合菌剂，其特征在于：由上述权利要求1-7中任一项所述的固体复合菌剂的制备方法制备而成，固体复合菌剂包括以下重量份数的原料：10-70份粪产碱菌、10-30份发酵纤维单胞菌、5-20份缺陷短波单胞菌、3-10份螯台球菌、1-5份拟杆菌、0.5-3份水微菌、0.2-2份乔治亚菌、德沃斯氏菌0.1-1.5份、0.05-0.5份代尔夫特菌。
9.一种固体复合菌剂的应用，其特征在于：将权利要求8的固体复合菌剂投入含氮废水中，控制温度10～40℃，ph为6～11。
技术总结
本发明涉及污水治理技术领域，具体涉及一种固体复合菌剂及其制备方法和应用，在污水源地收集样品并制成原菌液，将原菌液加入富集培养基中进行富集培养，再接种至反应器中加入液体培养基进行扩大培养，得到异养硝化好氧反硝化复合菌液，离心，除去上清液，加入干燥保护剂搅拌混合，加入辅料进行混合造粒，制得固体复合菌剂。本发明制备的固体复合菌剂适用范围广，环境适应能力强，在极端条件下依然能够快速繁殖，发挥作用，而且可同步进行硝化和反硝化，减少设备投入，降解效果好，更具有应用价值，便于运输保存。
技术研发人员：杨秋婵;刘静兰;张保安
受保护的技术使用者：广东中微环保生物科技有限公司
技术研发日：.11.25
技术公布日：.02.14
