本发明涉及一种氧化铁纳米微粒复合物、制备方法及其应用。
背景技术：
胰腺导管腺癌(pancreaticductaladenocarcinoma，pdac)是最致命的人类癌症之一，5年相对存活率约为6％，是癌症死亡的第7大原因。这可能是由于诊断时出现的严重的局部浸润或远处转移所致，pdac的晚期缺乏有效治疗。到目前为止，改善pdac预后的重要研究方向之一是胰腺癌的精准诊断，mri，尤其是增强的mr造影成像，是胰腺病变检测和诊断的重要工具，而在mr增强造影成像中，开发灵敏高效的造影剂则是mr增强成像研究中重要的方向之一。
近年来，抗体治疗在癌症治疗领域取得巨大进展，如来那替尼(人表皮生长因子受体－2激酶抑制剂)利妥昔单抗(抗cd20单克隆抗体)，pd1、pd－l1免疫检查点相关治疗的应用等。此外，针对癌症的多种抗体联合的疗法引起许多研究者的关注，多种抗体联合，作用靶点增多，增强治疗敏感性；同时，在检测或诊断方面，多个标志物组合或标志物谱系，如血清多种蛋白质组合进行检测或诊断肿瘤，能明显提高检测敏感度和精确度。
肿瘤相关生物标志物及其谱系已被证明可用于胰腺癌的诊断和治疗。粘蛋白是上皮细胞表面和腺体管腔之间屏障的重要组成部分，是一种高度糖基化的蛋白质，锚定于细胞膜，muc4在正常胰腺导管上皮细胞中不表达，在胰腺癌前病变和pdac中异常表达，muc4与胰腺癌的增殖、迁移、侵袭、远处转移等多种生物学行为相关，基于muc4的治疗亦已取得较好的抗肿瘤效果。癌胚抗原相关细胞粘附分子6(ceacam6)是糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白的癌胚抗原(cea)家族成员，ceacam6在肿瘤组织中高表达，而在正常组织中不表达或极低表达，异常表达的ceacam6与肿瘤细胞粘附，迁移，侵袭，转移，血管生成和耐药等密切相关，ceacam6应用于肿瘤的诊断或治疗亦取得较好效果。cd44变异体6(cd44v6)是大分子细胞粘附分子(cams)家族的成员，作为许多癌症的生物标志物越来越受到关注，我们前期研究发现cd44v6在胰腺癌mr成像和治疗中具有重要的应用价值，cd44v6有望成为胰腺癌的分子标志物。细胞膜表面肿瘤相关分子标志物与肿瘤的相关性是分子标志物诊断或治疗的基础，标志物与某种肿瘤相关性越强，则其对该肿瘤的敏感性越高，单一分子标志物与肿瘤的相关性有一定的局限性，分子标志物在肿瘤细胞的表达水平存在异质性，某些细胞可能表达标志物一，而不表达或低表达标志物二，当使用单一标志物进行检测或治疗时，不表达相应标志物的肿瘤细胞将不能被检测或识别，造成敏感度下降，这也是细胞膜表面肿瘤相关分子标志物诊断或治疗肿瘤敏感性不足的基本原因之一。当多个膜表面分子标志物或标志物谱系用于诊断或治疗肿瘤时，标志物之间可相互补充彼此在肿瘤细胞表面的表达差异，增强对肿瘤细胞的识别能力，增强敏感度，实现比单个分子标志物更敏感高效的诊断或治疗。
磁性氧化铁纳米粒子(ironoxidenanoparticles，ionps)已得到深入研究和开发，其中作为mri造影剂诊断肿瘤及作为载体载药治疗肿瘤时其重要研究方向。理想的mr造影剂，应具备优良的磁学性能，粒径小，分散性好，具备多样的表面修饰的潜能，低毒性和良好的生物相容性。实体肿瘤内具有异常的组织特征，尤其是肿瘤的新生血管，内皮结构不完整，管壁间隙宽，各种小分子物质能较易通过血管内皮，而ionps由于粒径小，随血流进入肿瘤组织后，可以更多地透过肿瘤血管进入肿瘤组织内部，滞留在肿瘤区域，称为增强的通透性滞留(enhancedpermeabilityandretention，epr)效应。ionps还可具备主动靶向能力，即人工地将各种与肿瘤相关的分子偶联到ionps表面，如短肽，蛋白质，抗体，核酸分子或其他小分子等，用于肿瘤的靶向，尤其是单克隆抗体的修饰，使ionps具备识别、结合肿瘤相应抗原的能力，达到精准靶向肿瘤的效果，备受研究者青睐；单链抗体(singlechainantibody，scab)修饰，作为ionps主动靶向策略的一种，与完整的单克隆分子修饰相比较，单链抗体修饰后ionps的粒径及空间位阻减小，可减弱网状内皮系统的吞噬作用及血液中其他物质的干扰，实现高效、低毒副作用的诊断或治疗；同时，ionps可荷载多种药物，如化疗药、sirna、各种抑制剂等进行靶向投递，实现肿瘤的靶向治疗。ionps具备被动靶向和主动靶向，且可同时荷载多种药物，可同时实现肿瘤的诊断或治疗，在肿瘤诊治领域具有广阔的研究和应用前景。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种集诊断和治疗于一体的双功能纳米材料。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种氧化铁纳米微粒复合物，该氧化铁纳米微粒复合物包括：聚乙二醇化的氧化铁纳米微粒、以及三种单链抗体表面修饰；三种单链抗体均与聚乙二醇化的氧化铁纳米微粒偶联；三种单链抗体分别为抗muc4单链抗体、抗ceacam6单链抗体、抗cd44v6单链抗体。
另一方面，本发明提供了一种制备上述氧化铁纳米微粒复合物的方法，其包括如下步骤：
s1、配制交联剂；
s2、活化羧基基团：将聚乙二醇化的氧化铁纳米微粒、活化缓冲液、步骤s1配制的交联剂混合并搅拌；
s3、加入偶联缓冲液：向步骤s2活化的氧化铁纳米微粒体系中加入偶联缓冲液，并充分混合；
s4、加入三种单链抗体：向步骤s3活化的氧化铁纳米微粒体系中加入抗muc4单链抗体、抗ceacam6单链抗体、抗cd44v6单链抗体，充分混合并连续搅拌。
根据本发明另一具体实施方式，上述制备方法进一步包括：
s5、反应后处理；所述步骤s5具体包括如下步骤：
s51：终止反应；
s52：多次分离；
s53：保存复合物。
根据本发明另一具体实施方式，上述制备方法中，制备抗muc4单链抗体的方法为：利用小鼠抗人muc4单克隆抗体，通过选择性切开完整的单克隆分子中重链铰链区的二硫键，获得抗muc4单链抗体。
根据本发明另一具体实施方式，上述制备方法中，制备抗ceacam6单链抗体的方法为：利用小鼠抗人ceacam6单克隆抗体，通过选择性切开完整的单克隆分子中重链铰链区的二硫键，获得抗ceacam6单链抗体。
又一方面，本发明提供了上述氧化铁纳米微粒复合物在治疗胰腺癌中的应用。实验证实，修饰三种单链抗体的ionps(ionps－peg－mcctriplescabs复合物)具有体内抗胰腺癌效应，肿瘤细胞增殖受抑、凋亡及坏死水平增加可能是其基本机制。因此，ionps－peg－mcctriplescabs复合物既可作为一种新型敏感高效的mr成像t2造影剂，同时也具有抗胰腺癌效应，即ionps－peg－mcctriplescabs是一种集诊断、治疗胰腺癌于一体的双功能纳米材料，有望实现临床转化。
再一方面，本发明提供了上述氧化铁纳米微粒复合物在诊断胰腺癌的mri成像中的应用。实验证实，单链抗体修饰的ionps可起到mr成像t2序列造影剂的作用。修饰三种单链抗体的ionps的阴性显影效果比修饰两种单链抗体的ionps效果更好，持续时间也更长；修饰两种单链抗体的ionps的阴性显影效果比修饰一种单链抗体的ionps效果更好，持续时间也更长。单链抗体修饰的ionps可聚集在肿瘤区域，脾脏滞留少，造影后无肝肾毒性。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
1、ionps－triplescabs可作为一种新型高效的胰腺癌mri造影剂。
2、ionps－triplescabs具有抗胰腺癌效应。
3、muc4、ceacam6、cd44v6与胰腺癌病人临床预后密切相关，靶向此三个分子的疗法有望改善胰腺癌临床预后。
4、ionps－triplescabs是一种集诊断与治疗一体的双功能纳米材料，有良好的临床转化潜能。
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
附图说明
图1是实施例1中，ionps-peg-mcctriplescabs复合物表征：流体动力学粒径(a)、zeta电位(b)、tem拍照(c)；体外mr成像(d)显示随着铁浓度升高，t2信号强度下降，ionps-peg-mcctriplescabs复合物的横向弛豫r2值为104.2mm-1s-1(e)；
图2是实施例1中，ionps－peg－mcctriplescabs偶联效率测定：muc4荧光抗体标准曲线(a)、ceacam6荧光抗体标准曲线(b)、cd44v6荧光抗体标准曲线(c)，每种抗体的偶联效率(d)。
图3是实施例1中，ionps－peg－mcctriplescabs复合物的肿瘤细胞毒性及对细胞周期和凋亡的影响：ionps－peg－mcctriplescabs复合物对胰腺正常导管上皮细胞h6c7的细胞毒性(a)，ionps－peg－mcctriplescabs复合物对胰腺癌细胞株bxpc－3细胞株的细胞毒性(b)；ionps－peg－mcctriplescabs复合物对肿瘤细胞bxpc－3的细胞周期(c)和凋亡(d)的影响；
图4是实施例1中，单链抗体(scab)修饰ionps体内mri成像；利用荷瘤裸鼠，全面评估ionps－peg以及修饰了一种、两种及三种单链抗体的ionps体内mrt2序列的成像效果，红色箭头指示为肿瘤；可见单链抗体修饰的ionps都能显著降低肿瘤区域的mrit2信号强度，肿瘤区域信号强度下降，即肿瘤区域变“暗”；随着修饰的单链抗体种类越多，其降低肿瘤区域的mrit2信号值的能力逐渐增强；
图5是实施例1中，mri成像后肿瘤区域t2信号值统计分析；每个时间点的t2信号强度值，均与注射前(0h)control作比；a：无单链抗体修饰的ionps－peg组中，t2信号值的变化；b，c，d：分别修饰scabmuc4、scabceacm6及scfvcd44v6的ionps，其t2信号值变化；e，f，g：分别修饰scabmuc4－scabceacam6、scabmuc4－scfvcd44v6、scabceacm6－scfvcd44v6的ionps，其t2信号值的变化；h：修饰了三种单链抗体的ionps(scabmuc4－scabceacam6－scfvcd44v6)，其t2信号强度变化；＊：p＜0.05；＊＊：p＜0.01；
图6为实施例1中，mri成像后裸鼠肝肾毒性评估：mri成像后，所有组的裸鼠血清谷丙转氨酶(a)及肌酐(b)的变化；
图7为实施例1中，mri成像后裸鼠体内铁分布：各个组皮下瘤组织普鲁士蓝染色(a)；ionps－peg组裸鼠的肝心脾肺肾脏器普鲁士蓝染色(b)；ionps－peg－mcctriplescabs组裸鼠的肝心脾肺肾普鲁士蓝染色(c)；
图8为实施例1中，ionps－peg－mcctriplescabs复合物体内抗胰腺癌效应；红色箭头指示为注射时点；ns组、ionps－peg组、ionps－peg－mcctriplescabs组的裸鼠体重变化(a)，开始注射药物治疗后皮下瘤体积的变化(b)，皮下瘤的质量(c)，抑瘤效应实验中皮下瘤大体图(d)；
图9为实施例1中，ionps－peg－mcctriplescabs复合物抑瘤实验后的组织学检查；h&e染色(a)中，dna等嗜碱性物质染成蓝色，细胞质后细胞外基质染成红色；ki－67的表达水平(b)中，ki－67阳性表达为棕色颗粒；以及tunel实验(c)中细胞核染成蓝色，凋亡相关复合物被染成棕色。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种氧化铁纳米微粒复合物(ionps－peg－mcctriplescabs)，该氧化铁纳米微粒复合物包括：聚乙二醇化的氧化铁纳米微粒、以及三种单链抗体表面修饰；三种单链抗体均与聚乙二醇化的氧化铁纳米微粒偶联；三种单链抗体分别为抗muc4单链抗体、抗ceacam6单链抗体、抗cd44v6单链抗体。该氧化铁纳米微粒复合物是一种集诊断和治疗于一体的双功能纳米材料，既可作为一种新型高效的胰腺癌mri造影剂，又具有抗胰腺癌效应，可用于胰腺癌的治疗。
一、三种单链抗体(抗muc4单链抗体、抗ceacam6单链抗体、抗cd44v6单链抗体)的合成
利用小鼠抗人muc4、小鼠抗人ceacam6单克隆抗体，通过选择性切开完整的单克隆分子中重链铰链区的二硫键，获得scabmuc4、scabceacam6。
将抗muc4单克隆抗体(1g/l)100μl加入到900μlpbs缓冲液(含edta，10mm，ph7.2)，利用超滤离心管，截留分子量5kd，3500r/min，20min，使最终液体体积为100μl，重复2次。将6mg的2－mea加入到上述抗体溶液中，轻轻充分混匀，37℃静置孵育90min，再利用超滤离心，截留分子量5kd，3500r/min，20min，再用pbs缓冲液(含edta，10mm，ph7.2)洗涤抗体，重复超滤3次，利用bradford蛋白质定量试剂盒测定超滤液中蛋白质浓度，将浓缩后的蛋白质用pbs缓冲液(含edta，10mm，ph7.2)稀释，使最终抗体浓度为2g/l。
抗ceacam6单链抗体的制备方法与抗muc4单链抗体制备方法相同。
抗cd44v6单链抗体由发明人课题组前期构建的人cd44v6噬菌体展示库提取而来。
二、ionps－peg－mcctriplescabs复合物的制备
ionps交联试剂盒中包含活化缓冲液、交联缓冲液、终止缓冲液及保存/洗涤缓冲液。利用活化缓冲液先配制2g/l、1g/l的edc/sulfo－nhs混合液，现配现用。将0.06ml的ionps(5g/l)吸取到1.5ml离心管，并加入0.06ml活化缓冲液，将30μl的edc/sulfo－nhs溶液加入到上述ionps中并充分混合，室温下连续搅拌10min，充分活化ionps表面的羧基官能团。将0.05ml偶联缓冲液加入到活化的ionps体系中，充分混合，并立即向活化的ionps中加入上述制备好的3种单链抗体各100μg，并再次充分混合，在室温下连续搅拌2h。往上述液体体系中加入10μl终止缓冲液，混合均匀，室温孵育10min，终止后的反应混合物转移到塑料比色皿中，加入3ml保存/洗涤缓冲液，轻轻混匀，将比色皿插入supermagseparatortm磁性分离装置中，4℃下分离12h－24h后，轻轻吸弃清液，再加入3ml保存/洗涤缓冲液，轻轻混匀ionps－peg－mcctriplescabs复合物，再置入磁性分离装置中分离，重复3次后用保存/洗涤缓冲液将ionps－peg－mcctriplescabs复合物配制成铁浓度为1g/l，scab总浓度1g/l，4℃保存备用。
三、ionps－peg－mcctriplescabs复合物的表征
ionps－peg－mcctriplescabs复合物的水溶液粒径由动态光散射(dynamiclightscattering，dls)测定，将制备好ionps－peg－mcctriplescabs复合物稀释成0.1g/l，超声振匀5min，加到比色皿中测定粒径分布及zeta电位，每个样品测5次。ionps－peg－mcctriplescabs复合物的透射电镜观察由tecnaig2透射电镜在120kv下完成，ionps－peg－mcctriplescabs复合物稀释成0.1g/l，吸取20μl到2ml烧杯中，加入1.5ml无水乙醇，将烧杯放入超声机上进行超声分散25min，吸取1μl分散后的ionps－peg－mcctriplescabs复合物滴在铜网上，在26℃环境中静置待液体完全挥发，将通铜网装在样品杆上，放入透射电镜进行观察、拍照。
四、ionps－peg－mcctriplescabs偶联效率测定
ionps－peg－mcctriplescabs复合物偶联效率的测定通过偶联带荧光素的抗体到ionps－peg上进行测定。将alexafluor647、alexafluor594及alexafluor488标记的抗muc4、抗ceacam6及抗cd44v6单克隆抗体，按照与单链抗体偶联的相同的方法和比例，连接到ionps－peg上，形成ionps－peg－triplefluoresceinlabeledmabs复合物，利用mdspectramaxm5多功能酶标仪测定已知浓度的荧光抗体(alexafluor488，最大激发波长495nm，最大发射波长519nm；alexafluor594最大激发波长590nm，最大发射波长617nm；alexafluor647最大激发波长650nm，最大发射波长668nm)最大激发和发射波长处的对应荧光强度，构建荧光强度－抗体浓度标准曲线，再测定ionps－peg－triplefluoresceinlabeledmabs复合物中对应荧光素的荧光强度，计算复合物中每种荧光强度对应的抗体浓度，再计算出每种抗体的偶联效率。
五、ionps－peg－mcctriplescabs复合物抗原识别特异性测定
ionps－peg－mcctriplescabs复合物及单纯ionps与胰腺癌细胞bxpc－3孵育48h，用pbs洗涤细胞3次，利用普鲁士蓝染色试剂盒，对bxpc－3细胞进行染色，染色完成后镜检。将ionps－peg－mcctriplescabs复合物作为细胞免疫荧光实验中的一抗，对复合物的抗原识别特异性进行检测。人胰腺癌细胞株bxpc－3，用含10％胎牛血清高糖dmem培养基培养至对数生长期，吸弃培养基，pbs洗涤细胞3次，用4％多聚甲醛室温固定20min，吸弃多聚甲醛，pbs洗涤3次，加入5％牛奶室温封闭30min，吸弃的封闭牛奶，pbs洗涤3次，加入5％牛奶配制的ionps－peg－mcctriplescabs复合物溶液(scabs总浓度为5mg/l)，室温孵育30min，吸弃ionps－peg－mcctriplescabs复合物，pbs洗涤3次，加入对应scab种属的alexafluor488标记的荧光二抗，荧光二抗稀释比例为1：200，室温避光孵育30min，吸弃荧光二抗，pbs洗涤3次，利用4’6－diamidino－2－phenylindoledihydrochloride(dapi)染核5min，吸弃dapi，pbs洗涤3次，荧光显微镜观察、拍照。
六、ionps－peg－mcctriplescabs复合物的表征
如图1所示：dls测定ionps－peg－mcctriplescabs复合物的平均粒径约为(23.6±0.5)nm，粒径分布集中，zeta电位约(－17.3±06)mv；tem显示粒径约10nm。
如图2所示：通过构建荧光强度－抗体浓度标准曲线，alexafluor488、alexafluor594及alexafluor647的荧光强度－抗体浓度曲线的标准曲线方程分别为y1＝2802.7x+166.36、y2＝2732.4x－60.473、y3＝2860.4x+186.73，方程拟合决定系数分别为0.9994、0.9999及0.999。ionps－peg－mcctriplescabs复合物偶联上3种荧光素标记的抗体后，进行荧光强度测定，获得scabmuc4、scabceacam6及scfvcd44v6对应的荧光强度值fi1、fi2、fi3，将fi1、fi2、fi3分别代入上述三个标准曲线，计算得到scabmuc4、scabceacam6及scfvcd44v6偶联在ionps－peg上的量，将偶联在ionps－peg上scab的量与初始加入偶联反应的scab的量作比，可计算出scabmuc4、scabceacam6及scfvcd44v6的偶联效率分别为75.33％、75.04％、75.40％。
可见，ionps－peg－mcctriplescabs复合物粒径小、分散性好、分布集中，表面呈弱负电位，每种单链抗体偶联到ionps表面的效率约为75％。ionps－peg－mcctriplescabs复合物具有良好的特异性。
七、ionps－peg－mcctriplescabs复合物体外mri成像性能及细胞效应
七0一、ionps－peg－mcctriplescabs复合物体外mri成像
ionps－peg－mcctriplescabs复合物体外mri成像利用含一系列fe梯度浓度的ionps在mri仪中扫描成像，即配制0mm、0.2mm、0.4mm及0.8mm铁的ionps－peg－mcctriplescabs复合物溶液，充分混匀，置入5ml离心管中，将离心管用非金属架子固定好，放入mri仪中，分别用t2wi：自旋回波，tr：2495.84ms，te：80ms，，层厚：1mm，fov：40x40mm，矩阵：64x64；t2mapping：自旋回波，tr：1500ms，te：8.3ms、16.6ms、24.9ms、33.2ms、41.5ms、49.8ms，层厚：1mm，，fov：40x40mm，voxelsize＝0.4mmx0.4mm；t2＊mapping：梯度回波，tr：795.71ms，te：5.11ms、11.11ms、17.11ms、23.11ms、29.11ms、35.11ms，flipangle：45°，层厚：0.8mm，fov：40x40mm，矩阵：112x112。这三个序列进行扫描，扫描完成后，利用imalyticspreclinicalsoftware(philipstechnologiegmbh，aachen，germany)数据处理系统对mri数据进行处理，计算每个铁浓度下肿瘤区域的t2信号强度值，构建1/t2－铁浓度曲线，曲线的斜率绝对值即为横向弛豫r2。
七0二、ionps－peg－mcctriplescabs复合物毒性试验
将h6c7与bxpc－3培养至对数生长期，用胰酶消化后，计数细胞，接种于96孔板，3000/孔；配置系列浓度梯度的无菌ionps－peg－mcctriplescabs溶液，其中抗体总量分别为0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml，此外还包括单纯ionps的铁200μg/ml，将上述系列浓度梯度的ionps及ionps－peg－mcctriplescabs与细胞共孵育，利用cck－8试剂盒，参照试剂盒的操作规程，分别在0h、6h、36h、72h及96h测定其od450的值，计算每个时间点、每个浓度下的细胞存活率，以每个时间点的0μg/ml作为对照组，计算每个时间点下每个浓度的细胞存活率。
七0三、ionps－peg－mcctriplescabs复合物对细胞周期、凋亡的影响
孵育条件为：总抗体浓度150μg/ml、孵育时间72h，利用ionps－peg－mcctriplescabs孵育bxpc－3细胞，孵育完后用pbs洗涤，胰酶消化成单个细胞，分别用细胞凋亡及细胞周期检测试剂盒，具体步骤参考试剂盒操作规程，检测bxpc－3细胞的周期和凋亡变化。
七0四、统计方法
mri数据采用imalyticspreclinicalsoftware(philipstechnologiegmbh，aachen，germany)数据处理系统进行。两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析。应用spss22.0forwindows统计软件进行统计学处理。显著性差异水平为p＜0.05。
七0五、ionps－peg－mcctriplescabs复合物体外mri性能
从图1d可以看出，随着fe浓度的增加，mrt2信号显著降低，ionps－peg－triplescab的r2值为104.2mm－1s－1。
七0六、ionps－peg－mcctriplescabs复合物细胞毒性实验
从图3a中可见：在h6c7细胞中，各个浓度的ionps－peg－mcctriplescabs均未出现明显的细胞毒性(p＞0.05)，在bxpc－3细胞中(b)，当总抗体浓度≥150μg/ml、孵育时间≥72h，出现明显的细胞毒性(p＜0.05)，而单纯的高浓度fe，并不出现细胞毒性。
七0七、ionps－peg－mcctriplescabs复合物的细胞学效应探索
基于细胞毒性实验的结果，我们探索了ionps－peg－mcctriplescabs复合物对肿瘤细胞bxpc－3细胞周期及凋亡状态的影响(图3c－d)。结果显示：一种单链抗体修饰的ionps和ionps－peg－mcctriplescabs复合物可诱导胰腺癌细胞bxpc－3出现细胞周期s期增多，同时细胞凋亡增加，修饰一种单链抗体的ionps阻滞细胞周期和诱导凋亡的能力比ionps－peg－mcctriplescabs弱。
七0八、结论
ionps－peg－mcctriplescabs对胰腺正常导管上皮细胞无毒性，对胰腺癌细胞具有毒性；单链抗体修饰的ionps可阻滞胰腺癌细胞有丝分裂周期，诱导凋亡，三种单链抗体修饰的ionps比一种单链抗体修饰的ionps具有更强的阻滞细胞周期和诱导凋亡的作用。
八、ionps－peg－mcctriplescabs体内mr成像、肝肾毒性及体内分布
八0一、裸鼠胰腺癌皮下种植瘤模型构建及mri成像、肝肾毒性及体内分布
选用4－6周龄，体重14－16g雌性裸鼠，利用bxpc－3细胞株，于右后肢腹侧皮下注射100μl含3.0x106bxpc－3细胞的dmem，每组5只，共有8组，分别为ionps－peg组、ionps－peg－scabmuc4组、ionps－peg－scabceacam6组、ionps－peg－scfvcd44v6组、ionps－peg－scabmuc4－scabceacam6组、ionps－peg－scabmuc4－scfvcd44v6组、ionps－peg－scabceacam6－scfvcd44v6组及ionps－peg－scabmuc4－scabceacam6－scfvcd44v6(ionps－peg－mcctriplescabs)组。待皮下瘤体积达到50－100mm3时，行mr成像。mri使用philips(achieva，best，thenetherlands)3.0t超导磁共振成像仪，8通道裸鼠专用线圈进行。裸鼠用1％戊巴比妥水溶液0.15ml腹腔注射后麻醉，放入线圈中，俯卧位固定，四肢展开，用棉片包裹保暖。先使用survey序列定位皮下瘤，再进行t2wi(自旋回波，横断面成像，tr：2495.84ms，te：80ms，，层厚：1mm，fov：40x40mm，矩阵：64×64)、t2mapping(自旋回波，横断面成像，tr：1500ms，te：8.3ms、16.6ms、24.9ms、33.2ms、41.5ms、49.8ms，层厚：1mm，，fov：40x40mm，voxelsize＝0.4mm×0.4mm)及t2＊mapping(梯度回波，横断面成像，tr：795.71ms，te：5.11ms、11.11ms、17.11ms、23.11ms、29.11ms、35.11ms，flipangle：45°，层厚：0.8mm，fov：40x40mm，矩阵：112x112)依次对皮下瘤进行扫描，所有图像信息均使用imalyticspreclinicalsoftware(philipstechnologiegmbh，aachen，germany).系统进行图像处理及分析。每个组的扫描时间点均为四个，即在注射前、注射后2h、注射后6h及注射后24h进行，8个组分别注射的药物为ionps－peg、ionps－peg－scabmuc4、ionps－peg－scabceacam6、ionps－peg－scfvcd44v6、ionps－peg－scabmuc4－scabceacam6、ionps－peg－scabmuc4－scfvcd44v6、ionps－peg－scabceacam6－scfvcd44v6及ionps－peg－scabmuc4－scabceacam6－scfvcd44v6(ionps－peg－mcctriplescabs)，每只裸鼠尾静脉注射一次，注射剂量为铁8μmol/kg体重，总体积为100μl。扫描完成后，将裸鼠充分麻醉，利用摘眼球取血法，采集每只裸鼠的全血，分离血清，进行谷丙转氨酶及肌酐的定量分析，分离每只裸鼠的皮下瘤组织及肝心脾肺肾脏器，进行包埋、切片及普鲁士蓝染色和h&e染色。
八0二、ionps－peg－mcctriplescabs体内mr成像效果
如图4所示，无单链抗体修饰的ionps各个时间点其mrit2信号值无明显变化；单链抗体修饰的ionps可显著降低裸鼠皮下肿瘤区域的mrt2信号值，在注射后6h信号值下降最明显(p＜0.05)，信号下降后，肿瘤横截面图像“变暗”。
如图5所示，对肿瘤区域(roi)t2信号强度值进行统计分析，以每组注射前的t2信号强度值作为基准，结果显示ionps－peg组4个时间点roi的t2信号强度无明显变化(p＞0.05)，修饰了一种单链抗体的ionps组，即ionps－peg－scabmuc4组、ionps－peg－scabceacam6组及ionps－peg－scfvcd44v6组裸鼠roi的t2信号值强度在注射后6h分别下降至注射前的69.6％、69.7％、65.7％(p均小于0.05)在其他时间点无统计学差异(p＞0.05)；修饰了两种单链抗体的ionps组，即ionps－peg－scabmuc4－scabceacam6组、ionps－peg－scabmuc4－scfvcd44v6组及ionps－peg－scabceacam6－scfvcd44v6组，裸鼠roi的t2信号值强度在注射后2h/6h出现下降，下降至注射前的69.2％/52.6％、67.1％/52.4％、66.4％/53.3％(p均小于0.05)；在ionps－peg－mcctriplescabs组中，裸鼠roi的t2信号值强度在注射后2h、6h及24h均出现下降，下降至注射前的56.9％、40.0％及66.8％(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.05)。
八0三、ionps－peg－mcctriplescabs造影后体内肝肾毒性
如图6所示：在mr造影成像后，8个组中，谷丙转氨酶、肌酐的浓度均无明显差异(p＞0.05)。
八0四、ionps－peg－mcctriplescabs造影后体内分布
如图7所示：8个组中，ionps注射后，肿瘤组织中未见蓝染颗粒，脾脏中出现较多的蓝染颗粒。在单链抗体修饰的ionps组中，肿瘤组织见较多蓝染颗粒，蓝染颗粒成弥漫细颗粒状分布，结构疏松的肿瘤组织中可见团块型的蓝染颗粒；在ionps－peg－mcctriplescabs组的肝心脾肺肾脏器中，肝心肺肾未见明显蓝染颗粒，脾脏中见极少的蓝染颗粒。
八0五、结论
单链抗体修饰的ionps可起到mr成像t2序列造影剂的作用，且修饰三种单链抗体的ionps的阴性显影效果比修饰一种或两种单链抗体的ionps效果更好，持续时间也更长。单链抗体修饰的ionps可聚集在肿瘤区域，脾脏滞留少，造影后无肝肾毒性。
九、ionps－peg－mcctriplescabs抗胰腺癌效应
九0一、裸鼠胰腺癌皮下种植瘤模型构建、抑瘤效应探索
胰腺癌皮下种植瘤模型参照八0一的内容进行。抑瘤效应分组探究分为3个组，即生理盐水组、ionps－peg组及ionps－peg－mcctriplescabs组。于裸鼠右侧后肢腹侧皮下注射100μldmem培养基(含3.0x106bxpc－3细胞)，每3－5天观察裸鼠皮下瘤生长情况及一般状况，测定皮下种植瘤体积，当皮下种植瘤体积达到50mm3时，每只裸鼠分别经尾静脉注射100μlns(生理盐水)、100μlionps－peg(fe：150μg/只)、100μlionps－peg－mcctriplescabs(总抗体：150μg/只)，注药周期为每3天注射1次，总共注射5次，注药期间每3天观察并记录裸鼠体重，皮下瘤的短径和长径，观察裸鼠的一般情况及皮下瘤的生长情况。在最后一次注射药物后第7天，将裸鼠麻醉后颈椎脱臼处死，分离皮下瘤，称重、拍照，进一步固定、包埋、切片，行h&e染色，tunel试验，以及用免疫组织化学染色检测肿瘤组织中ki－67的表达情况。
九0二、ionps－peg－mcctriplescabs体内抗胰腺癌效应
如图8所示，在三组中，对照组(ns组)和ionps组瘤体大小和重量相近，而ionps－peg－mcctriplescabs组中瘤体体积和质量明显低于ns组和ionps组(p＜0.001)，在三组中，裸鼠的体重变化无明显差异(p＞0.05)。
九0三、ionps－peg－mcctriplescabs抑瘤效应机制探索
如图9所示：抑瘤实验后，h&e染色中，ns组和ionps组的肿瘤组织形态完整，细胞组织轮廓清晰，无坏死物质或细胞碎片，在ionps－peg－mcctriplescabs组中，肿瘤组织中组织形态变形，轮廓欠清晰，可见无定型均质红染坏死物质。在免疫组织化学染色中，ki－67在ns组、ionps组中呈现极高表达，而在ionps－peg－mcctriplescabs组中呈现低表达；在tunel试验中，ns组和ionps组中见少量棕色颗粒，在ionps－peg－mcctriplescabs组中可见较多深棕色颗粒。
九0四、结论
ionps－peg－mcctriplescabs复合物具有体内抗胰腺癌效应，肿瘤细胞增殖受抑、凋亡及坏死水平增加可能是其基本机制。
虽然本发明以较佳实施例揭露如上，但并非用以限定本发明实施的范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的发明范围内，当可作些许的改进，即凡是依照本发明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。
技术特征：
1.一种氧化铁纳米微粒复合物，所述氧化铁纳米微粒复合物包括：聚乙二醇化的氧化铁纳米微粒、以及三种单链抗体表面修饰；所述三种单链抗体均与所述聚乙二醇化的氧化铁纳米微粒偶联；所述三种单链抗体分别为抗muc4单链抗体、抗ceacam6单链抗体、抗cd44v6单链抗体。
2.一种制备权利要求1所述氧化铁纳米微粒复合物的方法，其包括如下步骤：
s1、配制交联剂；
s2、活化羧基基团：将聚乙二醇化的氧化铁纳米微粒、活化缓冲液、步骤s1配制的交联剂混合并搅拌；
s3、加入偶联缓冲液：向步骤s2活化的氧化铁纳米微粒体系中加入偶联缓冲液，并充分混合；
s4、加入三种单链抗体：向步骤s3活化的氧化铁纳米微粒体系中加入抗muc4单链抗体、抗ceacam6单链抗体、抗cd44v6单链抗体，充分混合并连续搅拌。
3.如权利要求2所述的方法，其进一步包括：
s5、反应后处理；所述步骤s5具体包括如下步骤：
s51：终止反应；
s52：多次分离；
s53：保存复合物。
4.如权利要求2所述的方法，其中，制备抗muc4单链抗体的方法为：利用小鼠抗人muc4单克隆抗体，通过选择性切开完整的单克隆分子中重链铰链区的二硫键，获得抗muc4单链抗体。
5.如权利要求2所述的方法，其中，制备抗ceacam6单链抗体的方法为：利用小鼠抗人ceacam6单克隆抗体，通过选择性切开完整的单克隆分子中重链铰链区的二硫键，获得抗ceacam6单链抗体。
6.权利要求1所述氧化铁纳米微粒复合物在治疗胰腺癌中的应用。
7.权利要求1所述氧化铁纳米微粒复合物在诊断胰腺癌的mri成像中的应用。
技术总结
本发明提供了一种氧化铁纳米微粒复合物(IONPs－PEG－MCCtriple scAbs)，该氧化铁纳米微粒复合物包括：聚乙二醇化的氧化铁纳米微粒、以及三种单链抗体表面修饰；三种单链抗体均与聚乙二醇化的氧化铁纳米微粒偶联；三种单链抗体分别为抗MUC4单链抗体、抗CEACAM6单链抗体、抗CD44v6单链抗体。该氧化铁纳米微粒复合物是一种集诊断和治疗于一体的双功能纳米材料，既可作为一种新型高效的胰腺癌MRI造影剂，又具有抗胰腺癌效应，可用于胰腺癌的治疗。
技术研发人员：陈茵婷;黄开红;邹金茂;练国达;陈少杰;陈尚祥;李雅晴;李宣娜;谭莹
受保护的技术使用者：中山大学孙逸仙纪念医院;陈茵婷;黄开红;邹金茂
技术研发日：.08.09
技术公布日：.02.28
